[發明專利]乳酸/酸性環境促進無致瘤性的淋巴母細胞去分化獲得致瘤性的研究方法

有效

• 申請號: 201910981353.7
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN110964696B
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 楊萍;胡亞娥
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/0781;C12Q1/6886
• 代理公司: 南通市永通專利事務所(普通合伙) 32100
• 代理人: 葛雷

1.一種乳酸/酸性環境促進無致瘤性的淋巴母細胞去分化獲得致瘤性的研究方法，其特征是：包括下列步驟：

(1)細胞培養

HMY2-CIR細胞株的培養液是在DMEM高糖培養基中加入了10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，并且調節成不同的pH值；培養條件為5％CO₂，37℃；

(2)低pH培養基制備

20mM乳酸溶解于上述DMEM中，用pH計測試溶液的pH值，并且在培養基中加入鹽酸將溶液的pH值調至5.6和6.0；

(3)細胞形態學檢測

HMY2-CIR細胞分別用pH7.4,6.0和5.6的培養基培養八周，每三天換一次培養基，然后利用甩片機將細胞黏附到玻片上，用瑞姬氏染液進行染色；

(4)細胞增殖的測定

細胞增殖是用Alamar Blue assay進行檢測：將相同數量的HMY2-CIR細胞200μl加入96孔培養板中，并在每個孔中加上不同pH的培養基，用DMSO作為對照，培養三天后，在每個孔中加入10μl的Alamar Blue染液。并在37℃，5％CO₂的條件下繼續培養2小時，用SpectraMaxM5 multi-detection reader讀取560nm至590nm的吸光度值；

(5)集落生成實驗

HMY2-CIR細胞在不同pH值的培養液中培養了8周后，用新鮮的培養基洗兩遍，并且重懸計數；取1×10³個活細胞與Methocult H4230 methylcellulose混合后置于30mm培養皿中，并于37℃和5％CO₂條件下培養14天；14天后，對克隆的數量進行計數，大于50個細胞算作克隆，并用體視顯微鏡進行拍照；

(6)RT-PCR

從用乳酸處理過的HMY2-CIR細胞中提取總RNA；然后用RevertAid First Strand cDNASynthesis試劑盒和oligo(dT)引物進行逆轉錄，每20μL反應體系中含有5μg總RNA，還需要加入RNase-free DNase I；每一個25μL的RT-PCR反應體系中含有1μL cDNA和1μL TaKaRaTaq DNA聚合酶；反應條件為94℃4分鐘,94℃30秒，25-35個循環,58–68℃30秒,72℃1分鐘.RT-PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進行分離；所用的引物序列在表I中列出：

(7)數據分析

數據都是均值±方差；組別之間的差異都是用SPSS 16.0軟件進行分析；*P0.05代表有差異，**P0.01代表差異顯著。

2.根據權利要求1所述的乳酸/酸性環境促進無致瘤性的淋巴母細胞去分化獲得致瘤性的研究方法，其特征是：人B淋巴母細胞HMY2-CIR在含有20mM乳酸的培養液中培養72小時，并用Alamar Blue assay檢測細胞的增殖情況，*P0.05；

人B淋巴母細胞HMY2-CIR在20mM乳酸中培養8周后收取細胞，細胞計數后取1000個活細胞，加入甲基纖維素中，混勻后置于培養箱中；14天后，計數集落的數量，并用體式顯微鏡進行拍照，對計得的集落數量進行統計學分析，**P0.01；

人B淋巴母細胞HMY2-CIR在20mM乳酸中培養8周后收取細胞，提取總RNA后用RT-PCR檢測多個原癌基因的表達情況，條帶的灰度用Quantity One軟件進行掃描，并進行統計；這些實驗數據至少重復三次；*P0.05；**P0.01。