[發明專利]一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法

有效

• 申請號: 201910973836.2
• 申請日: 2019-10-14
• 公開（公告）號: CN110714045B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 余輝;莊黛娜;陳小娥;方旭波;陳潔
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

本發明屬于抗菌肽技術領域。本發明公開了一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法，其包括前處理、酶解、酶解后處理和提純等步驟，其中提純步驟中依次采用C18固相萃取柱、葡聚糖凝膠柱和半制HPLC色譜柱對細點圓趾蟹下腳料酶解產物中抗菌肽進行分離提純，制得細點圓趾蟹下腳料抗菌肽。本發明中細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法工藝簡單且成本較低；采用C18固相萃取柱、葡聚糖凝膠柱和半制備HPLC分離純化對細點圓趾蟹下腳料酶解產物中抗菌肽富集分離，操作方便且抗菌肽純度較高、易于工業化生產，所制備的抗菌肽的抑菌效果較強。

技術領域

本發明涉及抗菌肽技術領域，尤其是涉及一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法。

背景技術

抗菌肽是一類分子量較小，一般分子量為2000～7000Da，由12～50個氨基酸殘基組成，結構較為松散，具有抗菌活性。從第一個不具有完全意義上的抗菌肽Gramicidin被Hotchkiss發現以來，御素、天蠶素、蛙皮素等抗菌肽相繼被發現。近十幾年來，抗菌肽的功能作用逐漸受到關注。到現在為止，已經有超過5000多種抗菌肽被發現并分離鑒定，且研究數量每年都在快速增加。抗菌肽具有熱穩定性、光譜抗菌和不產生耐藥性等優點，有望取代抗生素成為一種新型的細菌抑制劑。

近年來，隨著海洋資源的衰退與快餐業的高速發展，新的蛋白資源開發迫在眉睫，低值細點圓趾蟹(Ovalipes punctatus)開發利用逐漸進入水產加工者的視野。細點圓趾蟹經蒸煮、人工挑取蟹螯和頭胸部的大塊蟹肉，再加工成冷凍蟹肉罐頭和蟹肉糜。由于細點圓趾蟹具有個頭小、肌肉組織松散等特點，加工過程中產生許多含肉下腳料，包括蟹螯、頭胸部和腹部殘留蟹肉以及難以加工的附肢和小蟹等，這些下腳料中殘留的蟹肉若不回收利用，不僅嚴重浪費蛋白資源，而且也會污染環境。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種能夠合理利用細點圓趾蟹下腳料并且具有操作方便、提純抗菌肽純度高、易于工業化生產的細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：

a)前處理：將細點圓趾蟹下腳料粉碎，然后進行脫脂處理、干燥粉碎后制得脫脂下腳料；

b)酶解：將脫脂下腳料加入水制得混合物，液料比為3～5：1(wt：vol)，然后向其中加入 0.3～0.4wt％ProteAX peptidase在45～55℃酶解處理4～5小時，制得酶解液；

c)酶解后處理：酶解液滅酶，然后離心處理得到上清液A，將上清液A蒸發濃縮并冷凍干燥制得抗菌肽粗品；

d)提純：將抗菌肽粗品用三氟乙酸溶解，離心處理制得上清液B，然后用C18固相萃取柱進行富集，收集合并具有抑菌活性的洗脫液，再用葡聚糖凝膠色譜進行分離純化，收集合并具有抑菌活性的洗脫峰，最后將具有抑菌活性肽真空濃縮后再經C18色譜柱進行分離純化，收集合并具有抑菌活性的洗脫峰，制得細點圓趾蟹下腳料抗菌肽。

作為優選，步驟a)前處理具體為，將細點圓趾蟹下腳料粉碎，然后將下腳料按料液比1:4～6(wt：vol)在無水乙醇+正己烷混合溶劑(1：2，vol：vol)中脫脂處理60～90分鐘，脫脂處理時溫度為45～55℃，抽濾后濾餅在75～85℃下干燥5.5～6.5小時，制得下腳料粉。

作為優選，步驟b)酶解前先將混合物的pH值調至7.8～8.6并在45～55℃水浴中處理0.5～1.5小時。

作為優選，步驟c)具體為，將酶解液在90～100℃下滅酶處理10～20分鐘，然后經流水冷卻至室溫，以4000～6000rpm的轉速離心處理8～13分鐘得到上清液A，將上清液A 在45～55℃下蒸發濃縮至固形物含量不小于70wt％，-18℃冷凍5h，真空冷凍干燥處理制得抗菌肽粗品。

作為優選，步驟d)中，三氟乙酸的濃度為0.08～0.12wt％。