[發明專利]一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法

有效

• 申請號: 201910973836.2
• 申請日: 2019-10-14
• 公開（公告）號: CN110714045B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 余輝;莊黛娜;陳小娥;方旭波;陳潔
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

a)前處理：將細點圓趾蟹下腳料粉碎，然后進行脫脂處理、干燥粉碎后制得脫脂下腳料；

b)酶解：將脫脂下腳料加入水制得混合物，液料比為3～5：1，然后向其中加入0.3～0.4wt％ProteAX peptidase在45～55℃酶解處理4～5小時，制得酶解液；

c)酶解后處理：酶解液滅酶，然后離心處理得到上清液A，將上清液A蒸發濃縮并冷凍干燥制得抗菌肽粗品；

d)提純：將抗菌肽粗品用三氟乙酸溶解，離心處理制得上清液B，然后用C18固相萃取柱進行富集，收集合并具有抑菌活性的洗脫液，再用葡聚糖凝膠色譜進行分離純化，收集合并具有抑菌活性的洗脫峰，最后將具有抑菌活性肽真空濃縮后再經C18色譜柱進行分離純化，收集合并具有抑菌活性的洗脫峰，制得細點圓趾蟹下腳料抗菌肽；

所述步驟d)中，C18固相萃取柱洗脫時，分別依次采用洗脫液含0.1wt％TFA的30wt％乙腈溶液和含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液進行洗脫，流速為1.0～2.0mL/min，收集含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液洗脫的洗脫液；

所述步驟d)中，葡聚糖凝膠柱洗脫時，上樣量為5mL，洗脫液為超純水，洗脫速度為1.0～2.0mL/min，收集合并洗脫48～51分鐘區間內的洗脫峰即得洗脫抗菌肽；

所用葡聚糖凝膠柱為Sephadex G-15色譜柱。

2.根據權利要求1所述的一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法，其特征在于：

所述步驟a)前處理具體為，將細點圓趾蟹下腳料粉碎，然后將下腳料按液料比4～6：1在無水乙醇和正己烷混合溶劑中脫脂處理60～90分鐘，脫脂處理時溫度為45～55℃，抽濾后濾餅在75～85℃下干燥5.5～6.5小時，制得下腳料粉。

3.根據權利要求1所述的一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法，其特征在于：

所述步驟b)酶解前先將混合物的pH值調至7.8～8.6并在45～55℃水浴中處理0.5～1.5小時。

4.根據權利要求1所述的一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法，其特征在于：

所述步驟c)具體為，將酶解液在90～100℃下滅酶處理10～20分鐘，然后經流水冷卻至室溫，以4000～6000rpm的轉速離心處理8～13分鐘得到上清液A，將上清液A在45～55℃下蒸發濃縮至固形物含量不小于70wt％，-18℃冷凍5h，真空冷凍干燥處理制得抗菌肽粗品。

5.根據權利要求1所述的一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法，其特征在于：

所述步驟d)中，三氟乙酸的濃度為0.08～0.12wt％。

6.根據權利要求1所述的一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法，其特征在于：

所述步驟d)中，離心處理的轉速為8000～12000rpm，處理時間為5～15分鐘。

7.根據權利要求1所述的一種細點圓趾蟹下腳料抗菌肽的制備方法，其特征在于：

C18色譜柱進行分離純化時，檢測波長為220nm，進樣量100μL，流速1～2mL/min，流動相為乙腈和含0.1％三氟乙酸溶液，洗脫方式為梯度洗脫，在30分鐘內乙腈含量有30wt％升高到55wt％，收集合并洗脫時間為18～20分鐘區間內的洗脫峰，制得細點圓趾蟹下腳料抗菌肽。