[發(fā)明專利]一種可反復(fù)消除的乙醇酸傳感器及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910972552.1
• 申請(qǐng)日: 2019-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN110684792B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧禹;徐淑敏;周勝虎;毛銀;李國(guó)輝;趙運(yùn)英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/6897;C12Q1/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了一種可反復(fù)消除的乙醇酸傳感器及其構(gòu)建方法，屬于合成生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以乙醇酸響應(yīng)蛋白GlcC和乙醇酸結(jié)合機(jī)理為基礎(chǔ)，增加遠(yuǎn)紅色熒光蛋白的表達(dá)，排除了傳統(tǒng)方法單細(xì)胞熒光中拷貝數(shù)及細(xì)胞大小造成的熒光信號(hào)干擾。本發(fā)明結(jié)合了大腸桿菌溫敏型復(fù)制子Ori101，實(shí)現(xiàn)了高溫培養(yǎng)反復(fù)消除。從而建立了一種精確反應(yīng)乙醇酸含量且能夠反復(fù)消除的乙醇酸生物傳感器。對(duì)于強(qiáng)化乙醇酸的生產(chǎn)策略尤其是誘變育種具有重要意義，不僅為高通量篩選提供了重要工具，而且其可反復(fù)消除的特性極大的縮短了育種時(shí)間。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種可反復(fù)消除的乙醇酸傳感器及其構(gòu)建方法，屬于合成生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

乙醇酸是極具工業(yè)價(jià)值的雙碳羥基羧酸，應(yīng)用于包裝、紡織、醫(yī)療和化妝品等領(lǐng)域。目前合成乙醇酸的方法主要是大腸桿菌以葡萄糖為底物全生物合成乙醇酸，具有價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高的優(yōu)點(diǎn)。若采取誘變育種的策略，乙醇酸的產(chǎn)量有望進(jìn)一步提升,為了建立乙醇酸快速檢測(cè)方法，根據(jù)乙醇酸和調(diào)控蛋白GlcC結(jié)合的機(jī)理，已構(gòu)建了檢測(cè)乙醇酸含量的生物傳感器。但是目前的傳感器伴隨著很多問題，如檢測(cè)的本底高，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)范圍小，GlcC對(duì)乙醇酸響應(yīng)不靈敏等問題，不能夠真正的應(yīng)用于高通量篩選。對(duì)此，建立一種信噪比高，反應(yīng)靈敏而且可反復(fù)消除的乙醇酸傳感器在高通量篩選生產(chǎn)菌株的過程中具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明更換glcC啟動(dòng)子元件，提供了一種本底低、檢測(cè)限高的生物傳感器，所述生物傳感器，是以乙醇酸響應(yīng)的調(diào)控蛋白GlcC為基礎(chǔ)構(gòu)建的反饋響應(yīng)系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)胞乙醇酸合成量增加后誘導(dǎo)綠色熒光蛋白的表達(dá)，從而將乙醇酸含量信號(hào)轉(zhuǎn)換為熒光信號(hào)。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種生物傳感器，包括P_glcD、glcC、第一標(biāo)記物基因、第二標(biāo)記物基因和溫敏型復(fù)制子Ori101；所述傳感器中的基因沿基因表達(dá)的方向依次為第一標(biāo)記物基因、glcC基因和第二標(biāo)記物基因；所述P_glcD調(diào)控第二標(biāo)記物基因的表達(dá)；所述P_glcD上整合GlcC-glycolate變構(gòu)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)；P_glcD的上游設(shè)置順式反應(yīng)元件上游增強(qiáng)因子UAS；所述啟動(dòng)子P_ffS位于glcC上游并調(diào)控glcC的表達(dá)；組成型啟動(dòng)子P_consensitive調(diào)控第一標(biāo)記物基因的表達(dá)。

在一種實(shí)施方式中，所述第一標(biāo)記物基因?yàn)檫h(yuǎn)紅色熒光蛋白基因FRFP基因；所述第二標(biāo)記物基因?yàn)榫G色熒光蛋白sfGFP基因。

在一種實(shí)施方式中，P_glcD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述P_glcC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述基因glcC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述UAS的序列如SEQ ID NO.4所示；所述FRFP基因的序列如SEQ ID NO.5所示。

在一種實(shí)施方式中，所述生物傳感器攜帶了一個(gè)組成型表達(dá)的紅色熒光蛋白，從而可以校準(zhǔn)由于不同細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒拷貝數(shù)不同和細(xì)胞體積不同所造成的信號(hào)差異。

在一種實(shí)施方式中，所述生物傳感器通過檢測(cè)所得綠色熒光強(qiáng)度與紅色熒光強(qiáng)度的比值作為最終信號(hào)強(qiáng)度，從而排除拷貝數(shù)不同的干擾。

在一種實(shí)施方式中，所述生物傳感器所在質(zhì)粒與大腸桿菌的溫敏型復(fù)制起點(diǎn)相結(jié)合，從而可實(shí)現(xiàn)在42℃連續(xù)傳代培養(yǎng)反復(fù)消除的效果。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以GlcC和其調(diào)控啟動(dòng)子P_glcD構(gòu)建傳感器，組成型表達(dá)遠(yuǎn)紅色熒光蛋白校準(zhǔn)了質(zhì)粒拷貝數(shù)和細(xì)胞大小所造成的誤差，并以不同乙醇酸濃度誘導(dǎo)，研究了GlcC蛋白對(duì)于乙醇酸的響應(yīng)范圍。發(fā)現(xiàn)乙醇酸濃度在0-150mM內(nèi)熒光比呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供攜帶所述傳感器的質(zhì)粒或細(xì)胞。