[發(fā)明專利]一種單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構建方法

在審

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• 申請日: 2019-10-13
• 公開（公告）號: CN110734958A
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發(fā)明（設計）人: 鞠巍;徐根明;潘藝;趙謙
• 申請（專利權）人: 湖南大地同年生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 43237 長沙睿翔專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 周松華;孫建霞

本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測領域，具體涉及一種單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構建方法。本發(fā)明利用類似5’RACE的SMART技術和特異性引物，可特異性捕獲并無偏好擴增人源RNA中所有低豐度TCRα、TCRβ、BCR重鏈H、BCR輕鏈L、BCR輕鏈K的整個CDR區(qū)域(可以單獨捕獲擴增其中一項，也可以同時捕獲擴增所有項目)，并采取一種簡單高效的方式對其進行高通量測序文庫的構建，從而進行TCR和BCR免疫組庫分析。

技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測領域，具體涉及一種單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構建方法。

背景技術

免疫組庫是指在任意指定時間點、個體內所有特異性不同的T淋巴細胞和B淋巴細胞克隆的總和。免疫組庫測序是運用高通量測序技術來研究TCR或BCR編碼基因多樣性的一項技術，通過該技術可以反應T/B細胞克隆變化與疾病的關系，此方法目前在腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病及移植等多個領域得到廣泛應用。

DNA和RNA均可成為免疫組庫的研究對象。但是，以DNA作為免疫組庫測序模板有以下缺點：①擴增過程使用大量的引物對，但是引物之間不可能完美地匹配擴增，易產生非真實性的重組序列；②J-C區(qū)之間存在大量內含子使其下游引物必須位于J區(qū)；③引物設計來自已知的參考序列，無法捕獲未知的序列。使用RNA作為模板建庫，下游引物可以選自C區(qū)，具有高度的敏感性，而且使用一對引物即可從低豐度的轉錄本中快速擴增cDNA的5’末端，可最大限度避免PCR擴增偏好性，并且可以捕獲未知的轉錄本。但是其也具有不可忽視的缺陷，例如，采用RACE方法進行建庫，其生成的文庫只包含可變區(qū)的一部分，只能對免疫組庫的TCR或BCR，或部分亞型進行建庫，并不能稱為真正的免疫組庫。

中國專利201410442470.3以全血mRNA為模板，基于5’RACE方法進行建庫，但是只能單一檢測TCR-β免疫組庫，并不能檢測TCR-α和BCR免疫組庫，并且在PCR過程中會引入錯配。

中國專利201510488029.3以cfDNA為模板，采用多重PCR擴增技術，能夠實現(xiàn)BCR H鏈和TCRβ鏈的免疫組庫檢測，但是一方面由于多重PCR本身的技術缺點，會偏好性地擴增某個區(qū)域，會存在非特異性擴增，另一方面此專利并沒有對TCR-α和BCR的輕鏈進行檢測，不能說是完整的免疫組庫。

除此之外，還有利用5’RACE或類似5’RACE方法進行建庫的方法，但多是利用dTPrimer進行RT，然后進行兩次PCR，最后再連接測序接頭進行建庫。這些方法，只能利用具有Poly A尾的RNA進行RT，對低豐度的轉錄本有局限性。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構建方法。

根據(jù)本發(fā)明具體實施方式的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構建方法，所述方法包括以下步驟：

(1)提取樣本總RNA；

(2)以步驟(1)得到的總RNA為模板，先后加入RT1引物、單分子標簽進行逆轉錄和模板轉換反應，得到帶單分子標簽的cDNA；

(3)以一鏈合成物為模板，加入TS-index引物和RT2引物，進行半巢式擴增，特異性擴增目標區(qū)域，并添加測序接頭，得到帶單分子標簽的DNA；

(4)將特異性擴增產物分選純化后，加入P7接頭引物、P5接頭引物，進行PCR擴增，得到測序文庫。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述的單分子標簽的序列如SQE ID NO.1所示。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述單分子標簽的3’末端還連接有多個簡并堿基，所述簡并堿基的個數(shù)為1-20個。

優(yōu)選地，所述簡并堿基為原始堿基和/或修飾堿基，所述修飾堿基包括硫代修飾、甲基化修飾、LNA修飾和/或次黃嘌呤修飾。