[發(fā)明專利]一種單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910972360.0
• 申請日: 2019-10-13
• 公開（公告）號: CN110734958A
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鞠巍;徐根明;潘藝;趙謙
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南大地同年生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 43237 長沙睿翔專利代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 周松華;孫建霞

1.一種單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)提取樣本總RNA；

(2)以步驟(1)得到的總RNA為模板，先后加入RT1引物、單分子標簽進行逆轉(zhuǎn)錄和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)，得到帶單分子標簽的cDNA；

(3)以一鏈合成物為模板，加入TS-index引物和RT2引物，進行半巢式擴增，特異性擴增目標區(qū)域，并添加測序接頭，得到帶單分子標簽的DNA；

(4)將特異性擴增產(chǎn)物分選純化后，加入P7接頭引物、P5接頭引物，進行PCR擴增，得到測序文庫。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的單分子標簽的序列如SQE ID NO.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，所述單分子標簽的3’末端還連接有多個簡并堿基，所述簡并堿基的個數(shù)為1-20個。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述簡并堿基為原始堿基和/或修飾堿基，所述修飾堿基包括硫代修飾、甲基化修飾、LNA修飾和/或次黃嘌呤修飾。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，所述RT1引物包括如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、和/或SEQ ID NO.10所示的序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)中，所述RT2引物包括如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.17所示的序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述RT2引物的3’末端還連接有原始堿基或修飾堿基，其中，所述修飾堿基包括硫代修飾、甲基化修飾、LNA修飾和/或次黃嘌呤修飾。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)中，所述TS-index引物的序列如SEQ ID NO.18所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4)中，P7接頭引物的序列如SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.18所示，P5接頭引物的序列如SEQ ID NO.20所示。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)溫度為25-50℃，反應(yīng)時間為30-90min。

11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述樣本包括人源TCRα、TCRβ、BCR重鏈H、BCR輕鏈L、BCR輕鏈K的CDR區(qū)域。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子標簽免疫組庫高通量測序文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法適用的技術(shù)平臺為第二代測序平臺。