[發(fā)明專利]適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法

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• 申請日: 2019-10-15
• 公開（公告）號: CN111455028A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設計）人: 袁嘉揚
• 申請（專利權）人: 蘇州艾可瑞斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)包含EGFR 18-21外顯子片段的質粒構建、轉化及提取

(1-1)序列檢索，根據(jù)不同的突變類型在相應的區(qū)域對于堿基進行修正以獲得包含合成目的片段；

(1-2)目的片段與質粒的連接；

(1-3)轉化；

(1-4)質粒抽提和瓊脂糖凝膠電泳的純化；

(2)核酸的片段化

(2-1)使用非接觸式超聲波破碎儀，完成步驟(1-2)中質粒的片段化，獲得長度為160～180bp的片段，使用片段分析儀對超聲后的碎片化DNA進行片段長度分析，確認碎片化的成果；

(2-2)使用非接觸式超聲波破碎儀完成對人來源肝癌細胞系Hu7，獲得長度為160～180bp的片段，使用片段分析儀對超聲后的碎片化DNA進行片段長度分析，確認碎片化的成果，該模板模擬人血漿cfDNA，作為本混合質控包的背景核酸；

(3)EGFR混合質控包的配置

(3-1)通過公式轉換計算理論預配置的質粒中包含的目的拷貝數(shù)，計算公式如下：6.02*10²³*質粒濃度×10^-9/DNA長度×660；

(3-2)采用梯度稀釋的方法，將模板稀釋到目的濃度以構成需要的質控品，目標濃度為1％；

(3-3)完成上述步驟的稀釋過程，獲得理論突變豐度為1％的樣本，使用血漿EGFRSuperARMs檢測試劑盒完成對上述樣本的定性檢測以驗證結果的準確度；

(3-4)使用自建的數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)完成對不同突變的準確定值；

(3-5)同時使用Illumina NGS檢測系統(tǒng)完成對上述樣本的二次定值；

(3-6)根據(jù)突變豐度的計算公式獲得1％的EGFR混合質控包。

2.根據(jù)權利要求1所述的適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法，其特征在于，步驟(1-2)的具體步驟為：

(1-2-1)建立連接反應體系，包括目的片段2～5μl、載體pUC57-Amp0.5～3μl、連接用反應液3～7μl、T4連接酶0.5～3μl；

(1-2-2)將步驟(1-2-1)中的連接反應體系混勻后，16℃連接30min，獲得包含有目的片段的質粒pUC57—19DEL。

3.根據(jù)權利要求1所述的適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法，其特征在于，步驟(1-3)的具體步驟為：

(1-3-1)取50μL感受態(tài)細胞置于冰上融化；

(1-3-2)加入5μL pUC57-19DEL，混勻，置于冰上靜置30min；

(1-3-3)42℃水浴中熱激90s，迅速置于冰上靜置2min；

(1-3-4)加入500μL無菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置于37℃，200rpm的恒溫搖床中培養(yǎng)1h，使細胞復蘇；

(1-3-5)將上述液體3000rpm離心5min，棄上清，留取少量LB，重懸沉淀，全部均勻涂布于LB培養(yǎng)板上，37℃倒置培養(yǎng)16～18h；

(1-3-6)16～18h以后，挑取單菌落于1ml含有氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌；

(1-3-7)3～4h以后，取一管用于后續(xù)試驗，將其他搖起來的菌株每管加入500ul 50％無菌甘油，于-80℃中凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.根據(jù)權利要求1所述的適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法，其特征在于，步驟(1-4)的具體步驟為：

(1-4-1)使用天根質粒中抽提試劑盒抽提上述步驟中獲得的質粒；

(1-4-2)將獲得的質粒DNA，按照一定的比例，加入限制性內(nèi)切酶NotI and NheI，同時完成酶切反應，從質粒載體上剝離目的片段；

(1-4-3)配置2％的瓊脂糖凝膠電泳，110V 30mins，加入DNA Ladder用于觀察目的片段的位置，反應后在紫外燈的照射下獲取長度在1750bp左右的包含目的片段的凝膠塊；

(1-4-4)將上述獲得的凝膠塊使用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒完成對目的片段的富集，保存于1.5ml EP管中，4℃?zhèn)溆茫?20℃長期保存，保存介質為TE溶液。

5.根據(jù)權利要求1所述的適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法，其特征在于，步驟(3-6)中，突變豐度的計算公式如下：

突變豐度＝突變型拷貝數(shù)/(突變型拷貝數(shù)+野生型拷貝數(shù))*100％。