[發明專利]適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法

在審

• 申請號: 201910971223.5
• 申請日: 2019-10-15
• 公開（公告）號: CN111455028A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 袁嘉揚
• 申請（專利權）人: 蘇州艾可瑞斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法，包括如下步驟：(1)包含EGFR 18?21外顯子片段的質粒構建、轉化及提取；(2)核酸的片段化；(3)EGFR混合質控包的配置。本發明的混合質控包以非小細胞肺癌EGFR為野生型的細胞系為背景，經過超聲震蕩實現片段化，無論是核酸片段的長度和多樣性均高度模擬人游離DNA。本發明的混合質控包包括目前國內獲批試劑盒中的主流突變，滿足目前臨床的主要需求，覆蓋EGFR基因18?21共計5個外顯子7個常見突變類型，且依據本技術路線，該混合質控包具備進一步拓展的能力，同時由于每個突變均單獨產生，因此可滿足不同客戶對于質控點的不同需求，實現定制化質控。

技術領域

本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一種適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法。

背景技術

液體活檢指通過非侵入性的方式取得人體體液標本(包括血液、尿液、腦脊液、漿膜腔液、唾液等)，通過對體液標本中實體組織來源的細胞、核酸、微粒體等的檢測，獲得其來源組織病理生理信息的檢查。狹義的液體活指檢針對腫瘤來源的生物學信息的檢測，廣義的液體活檢還包括母體血液中胎兒來源的核酸信息檢測，后者已在產前篩查、產前診斷中廣泛應用。針對腫瘤的液體活檢，因其具有無創，實時動態監測，反應整體腫瘤負荷、分子克隆及克隆轉換等信息，在腫瘤的篩查、診療決策、療效評價、復發監測及預后判斷等方面日益受到重視，成為近年來腫瘤臨床與基礎研究的熱點方向，其中循環腫瘤DNA更是被認為是新一代標志物的典范。

循環腫瘤DNA(ctDNA)是指原位腫瘤、轉移灶中凋亡與壞死的細胞釋放到外周血中的一類循環DNA。ctDNA半衰期較短，長度在160～200bp，占所有循環DNA的0.1％或更低。目前針對非小細胞肺癌患者，利用高敏感度的檢測平臺檢測外周血EGFR基因敏感或耐藥突變已成為臨床治療導則中的重要推薦用以指導抗腫瘤靶向治療的用藥決策。鑒于其具有無創、快速、覆蓋信息更為全面等特點，ctDNA檢測有廣大的臨床應用前景。

目前針對ctDNA的檢測平臺包括熒光定量PCR技術，數字PCR技術，二代測序等，為確保不同平臺的檢測技術均能夠給到理想的檢測結果，亟需一種全面的臨床質控品用于室內和室間質控活動以評估各個實驗室以及各個檢測平臺的檢測能力。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法，制備的混合質控包包括目前國內獲批試劑盒中的主流突變，滿足目前臨床的主要需求，覆蓋EGFR基因18～21共計5個外顯子7個常見突變類型，且依據本技術路線，該混合質控包具備進一步拓展的能力，同時由于每個突變均單獨產生，因此可滿足不同客戶對于質控點的不同需求，實現定制化質控。

為解決上述技術問題，本發明的實施例提供一種適用于多種EGFR游離DNA檢測試劑盒的混合質控包的制備方法，包括如下步驟：

(1)包含EGFR 18-21外顯子片段的質粒構建、轉化及提取

(1-1)序列檢索，根據不同的突變類型在相應的區域對于堿基進行修正以獲得包含合成目的片段；

(1-2)目的片段與質粒的連接；

(1-3)轉化；

(1-4)質粒抽提和瓊脂糖凝膠電泳的純化；

(2)核酸的片段化

(2-1)使用非接觸式超聲波破碎儀，完成步驟(1-2)中質粒的片段化，獲得長度為160～180bp的片段，使用片段分析儀對超聲后的碎片化DNA進行片段長度分析，確認碎片化的成果；

(2-2)使用非接觸式超聲波破碎儀完成對人來源肝癌細胞系Hu7，獲得長度為160～180bp的片段，使用片段分析儀對超聲后的碎片化DNA進行片段長度分析，確認碎片化的成果，該模板模擬人血漿cfDNA，作為本混合質控包的背景核酸；