[發(fā)明專利]一種基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)多態(tài)性SSR標記的方法

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• 申請日: 2019-10-12
• 公開（公告）號: CN110669834A
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發(fā)明（設計）人: 鄭興飛;胡中立;游艾青;周黎;徐得澤;費震江;董華林;胡建林;李珍連
• 申請（專利權）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6895;G16B20/30;G16B25/20
• 代理公司: 11335 北京匯信合知識產(chǎn)權代理有限公司
• 代理人: 王維新

本發(fā)明公開了一種基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)多態(tài)性SSR標記的方法，包括：S1、獲得目標物種多個樣本的轉(zhuǎn)錄組序列；S2、檢測潛在的SSR位點信息；S3、篩選獲得SSR位點重復基序類型與其相鄰核苷酸序列信息；S4、篩選樣本間多態(tài)性SSR候選位點；S5、對攜帶多態(tài)性SSR位點的轉(zhuǎn)錄組序列集，拼接為無重復的疊連群Uni?contig，依據(jù)其側(cè)翼保守序列設計引物，進行標記多態(tài)性檢測。能夠利用轉(zhuǎn)錄組序列有效篩選多態(tài)性的SSR標記，降低對計算機的配置要求，普通電腦即可完成，有效提高分子標記引物的有效性，縮短開發(fā)時間與成本，同時還可預測多態(tài)性SSR標記的PCR擴增片段長度及其連鎖基因功能信息，顯著提高轉(zhuǎn)錄組SSR標記的開發(fā)效率，促進分子輔助育種與功能基因研究。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)多態(tài)性SSR標記的方法。

背景技術

SSR標記，又稱為微衛(wèi)星DNA，是一種基于特異性引物PCR擴增的分子標記，由2到6個核苷酸序列重復基序組成。其標記兩端的序列較為保守，根據(jù)這一保守區(qū)域設計引物，通過PCR技術實現(xiàn)SSR位點擴增，可直接反映不同樣本或物種間該DNA片段的遺傳多態(tài)性。鑒于SSR標記多態(tài)性豐富且隨機分布于基因組中，目前已被廣泛應用于基因的快速定位、指紋圖譜構(gòu)建以及分子標記輔助選擇育種等研究。

按照其來源，SSR標記分為基因組(Genome)SSR標記和轉(zhuǎn)錄組SSR標記兩種類型。轉(zhuǎn)錄組SSR標記相對于基因組SSR標記具有以下優(yōu)點：(1)對于基因組序列未知的物種而言，開發(fā)成本低廉，高效；(2)由于轉(zhuǎn)錄組序列的種間保守性強，轉(zhuǎn)錄組SSR標記可在相近的種屬中使用，為生物進化和系統(tǒng)發(fā)育學的研究提供工具；(3)可與特定功能的基因緊密連鎖，更易與表型性狀相聯(lián)系。隨著高通量測序(NGS)技術的發(fā)展，低廉的價格即可獲得大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，而從其中的表達序列開發(fā)出來的SSR位點也得到了廣泛的應用，目前應用于遺傳圖譜的構(gòu)建、關聯(lián)分析、遺傳多樣性的評價、種質(zhì)資源的鑒定和系統(tǒng)進化學等研究。

可見，篩選并利用轉(zhuǎn)錄組SSR在分子生物學研究中具有重要地位。現(xiàn)有基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SSR的方法，效率較低，需要先通過分子生物學實驗驗證其可擴增性，進一步篩選多態(tài)性標記以供使用；同時，現(xiàn)有多態(tài)性SSR標記開發(fā)方法，多基于測序原始數(shù)據(jù)進行篩選，計算量偏大，對電腦要求較高。針對以上不足，本方法以轉(zhuǎn)錄組序列為對象，普通電腦即可實現(xiàn)樣本間共有SSR標記鑒定與多態(tài)性標記篩選，同時，增加了獲得SSR標記的真實性與多態(tài)性效率。目前，還未見有關此方法的相關報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)多態(tài)性SSR標記的方法，有效解決多態(tài)性SSR標記的常規(guī)篩選方法效率低，計算量大，可操作性差，對計算機配置依賴程度高的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案實現(xiàn)：

一種基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)多態(tài)性SSR標記的方法，包括以下步驟：

S1、獲得目標物種多個樣本的轉(zhuǎn)錄組序列；

S2、對每個樣本轉(zhuǎn)錄組序列，分別檢測潛在的SSR位點信息；

S3、對步驟S2中檢出的SSR位點信息，利用序列篩選程序進行篩選，獲得SSR位點重復基序類型與其相鄰核苷酸序列信息；

S4、對步驟S3中檢出的SSR位點重復基序與其核苷酸序列信息，采用Perl語言編寫程序，從中篩選樣本間多態(tài)性SSR候選位點；

S5、對步驟S4中攜帶多態(tài)性SSR位點的轉(zhuǎn)錄組序列集，拼接為無重復的疊連群Uni-contig，依據(jù)其側(cè)翼保守序列設計引物，進行標記多態(tài)性檢測。

作為上述方案的優(yōu)選，還包括以下步驟S6：利用獲得的SSR標記引物對，以目標物種的基因組DNA為模板，分別執(zhí)行PCR擴增，根據(jù)擴增結(jié)果驗證引物的有效性。