[發明專利]一種肺硬度基底體外細胞培養平臺的制備方法

有效

• 申請號: 201910964205.4
• 申請日: 2019-10-11
• 公開（公告）號: CN110628699B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 邢曉俠;吳思凡;崔杰峰;張希
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務所(普通合伙) 31287
• 代理人: 于曉菁

本發明提供了一種肺硬度基底體外細胞培養平臺的制備方法，包括將鼠尾I型膠原和DMEM基礎培養基分別按不同體積比混合，置于第一多孔板中；將鼠尾I型膠原、DMEM基礎培養液及CM?LV?LOXL2?OE按1：10：5體積比混合，置于第二多孔板中；將第一多孔板和第二多孔板放入37℃溫箱靜置；將成膠后的基底置于4℃冰箱中10～14h，形成不同基底硬度體外細胞培養平臺。本發明能夠較好地模擬體內1KPa低硬度臟器組織硬度變化，為尋找實體腫瘤發生肺轉移的共性分子特征，探討轉移靶器官重塑改造成“適宜土壤”的相關病理機制提供一種新型體外研究平臺。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種細胞培養技術，具體涉及一種模擬體內肺組織硬度的體外細胞培養平臺的制備方法及其在研究腫瘤肺轉移過程中預轉移龕形成機制中的應用。

背景技術

大量臨床數據顯示，許多實體腫瘤包括肝癌、食管癌、乳腺癌等均易發生肺轉移。尋找實體腫瘤發生肺轉移的共性分子特征，以及探討轉移靶器官在腫瘤定植轉移前重塑改造成“適宜土壤”的相關病理機制逐漸成為當前腫瘤轉移研究的新增長點，故能否建立起可反映肺組織硬度特征的理想體外研究平臺無疑對上述研究方向的推動將是顯著的。

在對腫瘤轉移認識的歷史進程中，曾出現過三個經典的腫瘤轉移學說，包括Paget的“種子土壤學說”，Ewing的“解剖機制學說”，以及Bross和Blumenson的“轉移瀑布學說”。上述三個學說分別從轉移非隨機性，轉移途徑，轉移的多因素、多階段三個不同角度對實體腫瘤轉移進行解釋，極大地促進人類對轉移機制的認識及轉移研究的深入。但鑒于經典理論缺乏將原發瘤和靶器官轉移灶聯系起來的“橋梁”，始終無法回答原發瘤如何選擇轉移靶器官，影響轉移灶形成。2005年預轉移龕學說(Premetastatic niche)的提出，將三種經典轉移學說進行了較好的匯集與融合，使原發瘤與轉移靶器官有機地聯系了起來，顯示出較強的理論創新與生命力，逐漸成為當前腫瘤轉移研究的新方向。該學說認為，原發瘤細胞分泌的部分可溶性因子TDSF或外泌體囊泡(exosome)作為“信使”，經體循環到達轉移靶器官，在靶器官募集骨髓來源的骨髓衍生細胞BMDCs，被募集的BMDCs細胞與TDSF、組織固有間質細胞在靶器官組織相互作用，使靶器官組織“土壤環境”重塑改造，形成有利于血液循環腫瘤細胞粘附與定植的預轉移龕，加速轉移在靶器官的最終實現。目前，“預轉移龕”已在一些腫瘤動物模型如乳腺癌、結腸癌，胰腺癌，黑色素瘤等中獲得證實。我們課題組前期也發現基質硬度可激活integrinβ1/α5/JNK/c-JUN信號通路上調肝癌細胞LOXL2表達分泌，加速肝癌肺預轉移龕形成，為從肺預轉移龕形成闡明肝癌轉移機制提供了新視角(J Exp ClinCancer Res.2018；37(1):99.IF 6.217)。

研究已經證實，腫瘤微環境的細胞組分(成纖維細胞、肝星狀細胞、血管內皮細胞、浸潤的免疫細胞、巨噬細胞、MSCs，DC等)與非細胞組分(生長因子、趨化因子、基質蛋白、exosome等)均參與腫瘤侵襲轉移的調控。除此之外，腫瘤周邊的物化因素包括缺氧、溫度、硬度、酸堿等參與腫瘤侵襲轉移的研究近年也逐漸增多。胞外基質硬度是細胞微環境的一個重要物理參數，其變化可改變錨著細胞所處的機械力學環境，使細胞形態特征、粘著斑裝配、細胞骨架狀態有很大變化，這些變化可顯著影響參與體內多種病理生理過程如組織發育、纖維化、腫瘤轉移等。作為實體腫瘤的顯著物理特征，基質硬度與腫瘤發生發展密切關聯已獲得臨床大量數據的支撐，但其如何調控腫瘤發生進展的相關分子機制研究目前卻依然處于起步階段，缺乏理想體外硬度相關實驗平臺是制約硬度相關研究開展的最主要障礙。