[發明專利]一種快速合成全基因序列的方法及其應用

在審

• 申請號: 201910960291.1
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN110551802A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 劉芳
• 申請（專利權）人: 周口師范學院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 61223 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 崔瑞迎

本發明屬于基因工程技術領域，公布了一種用短DNA引物拼接目標基因全長序列的方法及其應用。本發明建立的拼接技術分為兩個步驟：第一，短DNA引物通過互補區相互退火，在DNA聚合酶的作用下補齊gaps，產生帶有切刻位點的雙鏈模板；第二，通過基因兩端的上下游引物，以第一步反應的產物為模板，擴增全長序列。本發明還提供了一種用python語言實現的計算機算法，用以自動設計用于合成基因全長序列的短DNA引物。利用本技術在構建多重突變體基因時，僅需找到對應位點所在的DNA引物，進行堿基替換后直接用新合成的引物替換原來的引物，經過簡單的PCR擴增，即可得到無模板殘留干擾的突變體基因。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種快速合成基因全長序列的方法及其應用。

背景技術

要獲得某一基因的DNA序列，可以從宿主的基因組DNA中PCR擴增出目標片段，也可以在DNA合成公司直接合成。前者往往需要專門購買菌株，提取基因組DNA，周期較長，操作繁瑣。后者往往需要較長的周期和較高的成本，而且大多數公司返回的合成產物是重組質粒，會不可避免的引入酶切位點，對于不使用任何酶切位點的無縫同源重組的克隆方法并不適合。

Rouillard等(Rouillard J M,Lee W,Truan G,et al.Gene2Oligo:oligonucleotide design for in vitro gene synthesis[J].Nucleic acids research,2004,32(suppl_2):W176-W180.)報道了一種僅僅合成單鏈引物，經過相互退火，連接酶連接，然后再加入特異性的上下游引物PCR擴增，得到基因全長序列。這種方法有較高的準確性，但是由于對正、負鏈都要全覆蓋，需要合成大量的寡核苷酸引物，并且需要體外磷酸化，合成成本較高。

進一步的，為了研究基因編碼產物的功能，經常需要對基因進行突變，常見方法有重疊延伸PCR和同源重組，這兩種方法都是基于特異性突變引物的，每個突變位點都需要一對特異性引物來引入突變。當需要多位點突變時，重疊延伸PCR和同源重組都需要多次連續的PCR，操作繁瑣。而且新構造的突變體都需要上一步的基因做模板，最終得到的產物混有少量的其他突變型，對目標突變體的篩選產生干擾。陳立涵等建立了一種在目的基因內部構建多位點突變的方法，他們采用磷酸化引物進行反向PCR，產物經連接反應可以自連為環，甲基化后作為下一輪PCR的模板，PCR產物經DpnI處理去除原基因型，即得到新的突變體(陳立涵,等：一種快速構建基因多個點突變體方法的建立。生物化學與生物物理進展,2013,40(7):678-685)。該方法減少了干擾基因型，產物為重組質粒便于測序和表達，但仍需要多次PCR，不夠簡便。

發明內容

本發明旨在提供一種快速合成基因全長序列的方法，以解決上述背景中的技術問題。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種快速合成基因全長序列的方法，包括以下步驟：

S1，第一步PCR，將相同濃度的若干條短DNA引物，加入到高保真DNA聚合酶反應混合液中，進行PCR擴增，得擴增產物；

S2，第二步PCR，以第一步的擴增產物為模板，在高保真DNA聚合酶反應混合液中，加入全基因序列的上下游引物，通過PCR反應程序，合成全基因序列；

S3，將第二步PCR的產物純化回收，然后把回收產物與線性載體重組，轉化大腸桿菌感受態細胞，提取重組質粒通過DNA測序確認合成基因的準確性。

進一步的，上述短DNA引物設計方法，包括以下步驟：