[發明專利]一種快速合成全基因序列的方法及其應用

在審

• 申請號: 201910960291.1
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN110551802A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 劉芳
• 申請（專利權）人: 周口師范學院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 61223 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 崔瑞迎

1.一種快速合成基因全長序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，第一步PCR，將相同濃度的若干條短DNA引物，加入到高保真DNA聚合酶反應混合液中，通過PCR反應程序，得PCR產物；

S2，第二步PCR，以第一步的PCR產物為模板，在高保真DNA聚合酶反應混合液中，加入全基因序列的上下游引物，通過PCR反應程序，合成全基因序列；

S3，將第二步PCR的產物純化回收，然后把回收產物與線性載體重組，轉化大腸桿菌感受態細胞，提取重組質粒通過DNA測序確認合成基因的準確性。

2.根據權利要求1所述的一種快速合成基因全長序列的方法，其特征在于，S1所述短DNA引物的設計方法，包括以下步驟：

步驟1，設計公式式中N代表引物數目，X代表全基因序列長度，a代表相鄰引物間重疊序列的長度，a≥17，b代表引物序列的長度，b≤59，符號代表向上取整；計算需要合成的短DNA引物的數目，先令b＝59，若N為偶數，b＝59，若N為奇數，將b－1，直到N為偶數，此時b的值就是引物的長度；

步驟2，以待合成基因5’端第一個堿基起始，截取長度為b的序列作為第一條引物，從第一條引物末尾向前移動a個堿基作為下一條引物的起始，依次類推，直到目的基因末尾；

步驟3，將S2中截取的全部引物按順序編號，當引物序號為偶數時，對其序列取反向互補,得短DNA引物。

3.根據權利要求1所述的一種快速合成基因全長序列的方法，其特征在于，在S1中，第一步PCR的所述短DNA引物的最終濃度為20nM，所述高保真DNA聚合酶混合液中聚合酶的用量為0.25-0.5U，dNTPs的濃度為0.15mM，所述PCR反應程序中，退火溫度為55℃，延伸溫度為68℃，循環數為5。

4.根據權利要求1所述的一種快速合成全基因序列的方法，其特征在于，在S2中，第二步PCR的每50uL反應體系中，所述模板的用量為1uL，所述高保真DNA聚合酶混合液中聚合酶的用量為0.5-1U，dNTPs的濃度為0.2mM，所述PCR反應程序中，退火溫度不低于60℃，延伸溫度為68℃，循環數為22。

5.一種設計權利要求2所述短DNA引物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)，定義一個變量“dna”，用于儲存輸入的基因序列的字符串，然后將字符串中的非堿基字符去除，賦值給長度變量“seq”；

(2)，根據“seq”的長度和可指定的重疊區長度，并先假設引物的長度為59，計算所需引物數目x，x必須為偶數，否則將引物的長度減1，直到x為偶數，然后利用字符串切分的方法將“seq”逐個切分為指定長度的短字符串，直到字符串的末尾；

(3)，定義一個函數com_rev()，用于將引物按照DNA的堿基互補原則轉換為反向互補序列，然后將序號為偶數的引物轉換為反向互補序列，得短DNA引物。

6.根據權利要求5所述的設計短DNA引物的方法，其特征在于，所述重疊區長度指定時，至少為17bp；若不指定默認為19bp。

7.權利要求1-4任一項所述的快速合成全基因序列的方法在DNA片段合成及DNA序列突變中的應用。