[發明專利]一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的引物組合、試劑盒和PSR方法

在審

• 申請號: 201910959691.0
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN110628923A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 王靜;劉威;慈穎;張喬;張曉龍;楊燕;孫筱霞
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 11465 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 王敏

本發明公開了一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的引物組合、試劑盒和PSR方法，屬于生物檢測技術領域。本發明能夠通過鈣黃綠素顯色法、pH指示劑顯色法、濁度法或熒光法對肺炎克雷伯桿菌進行檢測。本發明的檢測方法操作簡便，反應時間短，靈敏度高，是普通PCR反應的10倍，特異性強，僅能檢測出肺炎克雷伯桿菌。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，更具體的說是涉及一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的引物組合、試劑盒和PSR方法。

背景技術

肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)是一種主要的導致體內感染的革蘭氏陰性菌，它會引起肺炎、泌尿道和傷口感染等疾病，在嬰兒、糖尿病患者、腫瘤患者、長期使用抗生素的病人和老年人中發病率高。此外，近些年來越來越普遍的耐藥肺炎克雷伯桿菌已成為臨床上一個重要難題，因此需要建立一種快速和敏感的檢測方法。

肺炎克雷伯桿菌的傳統檢測方法包括基于表型和生理生化指標的微生物鏡檢法、生化鑒定法和最新的全自動細菌鑒定儀，但這些方法耗時長、靈敏度低，經常需要數天的細菌培養時間。近些年來，一系列新發明的分子生物學技術被用來檢測肺炎克雷伯桿菌，如用基于16S-23S內部轉錄間隔區的PCR在嬰兒奶粉中檢測肺炎克雷伯桿菌，也有三重PCR和實時熒光定量PCR的肺炎克雷伯桿菌檢測技術，然而這些技術都相對比較復雜，需要專業的、昂貴的儀器，此外PCR中使用的Taq酶容易被原始樣本中的抑制物抑制而失活。

因此，提供一種利用聚合酶螺旋反應(PSR)檢測肺炎克雷伯桿菌的方法是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的引物組合、試劑盒和PSR方法，操作簡單，靈敏度高，特異性強。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

莢膜多糖(CPS)是肺炎克雷伯桿菌的重要致病因子，而rcsA基因調控莢膜多糖的合成，并且是肺炎克雷伯桿菌的特有基因，因此本發明選它作為肺炎克雷伯桿菌檢測的靶基因，根據rcsA基因序列設計一套PSR引物，并評價其最佳溫度、特異性和敏感性，最終用完善后的方法來應用于樣本檢測。

一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的引物組合，具體引物序列如下：

rcsA-Ft1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGTAAAAAACAGGAAATCGTTGAGG-3’；SEQ IDNO.1；

rcsA-Bt1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGGCGAATAATGCCATTACTTTC-3’；SEQ IDNO.2；

rcsA-IF：5’-ATCCGCAGCACTGTTGA-3’；SEQ ID NO.9；

rcsA-IB：5’-GAAGACTGTTTCGTGCATGATGA-3’；SEQ ID NO.10。

進一步，含有上述引物組合的試劑盒。

一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的PSR方法，包括如下步驟：用上述的引物組合對待測樣本進行PSR反應，檢測PSR反應產物，確定待測樣本是否為肺炎克雷伯桿菌。

進一步，所述PSR反應體系如下：12.5μl的2×RM，2.0μl DNA模板和1.0μl Bst DNA聚合酶，引物的rcsA-Ft1、rcsA-Bt1各1.6μM，rcsA-IF、rcsA-IB各0.8μM，并用水補齊25μl。

進一步，所述PSR反應條件為65℃，60min。

進一步，所述確定待測樣本是否為肺炎克雷伯桿菌的方法為a、b、c或d：

a、鈣黃綠素顯色法