[發明專利]一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的引物組合、試劑盒和PSR方法

在審

• 申請號: 201910959691.0
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN110628923A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 王靜;劉威;慈穎;張喬;張曉龍;楊燕;孫筱霞
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 11465 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 王敏

1.一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的引物組合，其特征在于，具體引物序列如下：

rcsA-Ft1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGTAAAAAACAGGAAAT CGTTGAGG-3’；SEQ ID NO.1；

rcsA-Bt1：5’-CGACGTACAGTGTTTCTGCAGGCGAATAATGCCATTAC TTTC-3’；SEQ ID NO.2；

rcsA-IF：5’-ATCCGCAGCACTGTTGA-3’；SEQ ID NO.9；

rcsA-IB：5’-GAAGACTGTTTCGTGCATGATGA-3’；SEQ ID NO.10。

2.含有權利要求1所述引物組合的試劑盒。

3.一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的PSR方法，其特征在于，包括如下步驟：用權利要求1所述的引物組合對待測樣本進行PSR反應，檢測PSR反應產物，確定待測樣本是否為肺炎克雷伯桿菌。

4.根據權利要求3所述的一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的PSR方法，其特征在于，所述PSR反應體系如下：12.5μl的2×RM，2.0μl DNA模板和1.0μlBstDNA聚合酶，引物的rcsA-Ft1、rcsA-Bt1各1.6μM，rcsA-IF、rcsA-IB各0.8μM，并用水補齊25μl。

5.根據權利要求3所述的一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的PSR方法，其特征在于，所述PSR反應條件為65℃，60min。

6.根據權利要求3所述的一種用于檢測肺炎克雷伯桿菌的PSR方法，其特征在于，所述確定待測樣本是否為肺炎克雷伯桿菌的方法為a、b、c或d：

a、鈣黃綠素顯色法

在PSR反應體系中加入1.0μl鈣黃綠素指示劑；恒溫擴增反應結束后，若待檢樣品反應管液體呈黃綠色，表示檢出肺炎克雷伯桿菌，該樣品檢測結果為陽性；若待檢樣品反應管液體呈橙紅色，表示未檢出肺炎克雷伯桿菌，檢測結果為陰性；

b、pH指示劑顯色法

在PSR反應體系中加入1.0μlpH指示劑；恒溫擴增反應結束后，若待檢樣品反應管液體呈黃色，表示待測樣本中存在肺炎克雷伯桿菌；若待檢樣品反應管液體呈紅色，表示待測樣本中不存在肺炎克雷伯桿菌；如果陰性對照管變為黃色，或者陽性對照管50分鐘內顏色無變化，則本次檢測結果無效，應重新檢測；

c、濁度法

濁度儀檢測所述待測樣本PSR反應產物濁度變化曲線，若所述待測樣本PSR反應產物濁度變化曲線呈S型反應曲線，則待測樣本中存在肺炎克雷伯桿菌，若所述待測樣本PSR反應產物濁度變化曲線未形成明顯S型反應曲線，則所述待測樣本中不存在肺炎克雷伯桿菌；

d、熒光法

陽性反應的表現為：在反應階段出現S型擴增曲線，且溶解曲線為單一峰；陰性反應的表現為：在反應階段無擴增曲線，且溶解曲線無峰出現；結果判定標準：在陽性對照發生陽性反應且陰性對照發生陰性反應的前提下，待檢樣本在反應階段出現S型擴增曲線，且溶解曲線為單一峰，并與陽性對照單一峰位置接近，此時待檢樣本判斷為陽性，否則為陰性；如果陽性待檢樣本發生了陰性反應，或者陰性待檢樣本發生了陽性反應，應重新檢測。