[發(fā)明專利]檢測非抑菌固氮菌的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910959509.1
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN110607341A
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫璟;吳雋松
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/10
• 代理公司: 11614 北京思創(chuàng)大成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 高爽

1.一種檢測非抑菌固氮菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)獲取土壤樣本，將所述土壤樣本接種于Ashby固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

(2)如果步驟(1)的培養(yǎng)結(jié)果是未出現(xiàn)單菌落，則所述土壤樣本中不含有固氮菌；如果步驟(1)的培養(yǎng)結(jié)果是出現(xiàn)單菌落，則挑取部分或全部所述單菌落分別進行劃線培養(yǎng)，分離獲得多個單菌株；

(3)挑取所述多個單菌株中的一個單菌株接種于Ashby液體培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液；

(4)去除所述發(fā)酵液中的菌株，獲得去除該菌株的發(fā)酵液；

(5)將指示菌接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，獲得所述指示菌；

(6)將所述指示菌接種于有氮源的葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中，并向部分有氮源的葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中加入步驟(4)獲得的所述去除菌株的發(fā)酵液，進行培養(yǎng)，分別獲得有氮源不加該發(fā)酵液的培養(yǎng)液以及有氮源加該發(fā)酵液的培養(yǎng)液；

(7)重復(fù)步驟(3)-步驟(6)；

(8)對所有的有氮源不加該發(fā)酵液的培養(yǎng)液和所有的有氮源加該發(fā)酵液的培養(yǎng)液中的所述指示菌的生物量進行檢測，根據(jù)所述生物量的大小判斷所述土壤樣品中是否含有非抑菌固氮菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(8)中，根據(jù)所述生物量的大小判斷所述土壤樣品中是否含有非抑菌固氮菌包括：

如果部分或者所有的有氮源加該發(fā)酵液的培養(yǎng)液的OD₆₀₀值大于所有的有氮源不加該發(fā)酵液的培養(yǎng)液的OD₆₀₀值，則所述土壤樣本中含有非抑菌固氮菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：(9)獲取該非抑菌固氮菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ashby固體培養(yǎng)基由以下重量份的組分制成：8.0-15.0重量份的葡萄糖，0.15-0.25重量份的磷酸氫二鉀，0.15-0.25重量份的硫酸鎂，0.15-0.25重量份的氯化鈉，0.05-0.15重量份的二水硫酸鈣，3.0-6.0重量份的碳酸鈣，16.0-20.0重量份的瓊脂，以及1000重量份的蒸餾水；pH值為6.5-8.0；

所述Ashby液體培養(yǎng)基由以下重量份的組分制成：8.0-15.0重量份的葡萄糖，0.15-0.25重量份的磷酸氫二鉀，0.15-0.25重量份的硫酸鎂，0.15-0.25重量份的氯化鈉，0.05-0.15重量份的二水硫酸鈣，3.0-6.0重量份的碳酸鈣，以及1000重量份的蒸餾水；pH值為6.5-8.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述去除每一個所述發(fā)酵液中的菌株為，以8000r/min對所述發(fā)酵液進行離心10min，取上清液，之后利用濾膜對所述上清液進行過濾除菌。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述指示菌為非固氮微生物。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述非固氮微生物為大腸桿菌或者植物乳桿菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述非固氮微生物為大腸桿菌。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述種子培養(yǎng)基為有氮源的葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于，所述有氮源的葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基由以下重量份的組分制成：3.0-6.0重量份的氯化鈉，0.15-0.25重量份的七水硫酸鎂，0.05-0.20重量份的磷酸二氫銨，0.05-0.20重量份的磷酸氫二鉀，1.0-10.0重量份的葡萄糖，以及1000重量份的蒸餾水；pH值為6.0-8.0。