[發明專利]檢測非抑菌固氮菌的方法

在審

• 申請號: 201910959509.1
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN110607341A
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發明（設計）人: 孫璟;吳雋松
• 申請（專利權）人: 江蘇醫藥職業學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/10
• 代理公司: 11614 北京思創大成知識產權代理有限公司
• 代理人: 高爽

本發明屬于微生物技術領域，涉及一種檢測非抑菌固氮菌的方法。該方法包括以下步驟：(1)獲取土壤樣本，將土壤樣本接種于Ashby固體培養基中培養；(2)挑取部分或全部單菌落分別進行劃線培養，分離獲得多個單菌株；(3)挑取多個單菌株中的一個接種于Ashby液體培養基中，進行發酵培養，獲得發酵液；(4)獲得去除該菌株的發酵液；(5)獲得指示菌；(6)將指示菌接種于有氮源的培養基中，并向部分培養基中加入去除菌株的發酵液，進行培養，分別獲得有氮源不加該發酵液的培養液和有氮源加該發酵液的培養液；(7)重復步驟(3)?(6)；(8)對所有的培養液的生物量進行檢測，根據生物量判斷土壤樣品中是否含有非抑菌固氮菌。該方法快速準確。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，更具體地，涉及一種檢測非抑菌固氮菌的方法。

背景技術

資源和環境問題是目前人類最關注的問題。化肥的大量使用和有機肥施用不足導致土壤養分比例失調，使得土壤質量下降。微生物肥料因具有肥效高、無毒、不污染環境等特點而成為化肥的有效替代品。微生物肥料所含有的微生物菌劑是其發揮作用的關鍵，尤其復合菌劑，對農作物生長增產及土壤綜合治理起到重要作用。

固氮菌能夠將空氣中或土壤中的無機氮轉化為有機氮，為植物提供營養，因此是一種很好的微生物菌劑，能夠增加土壤的肥力。然而，具有抑制其他微生物生長的固氮菌(簡稱抑菌固氮菌)在固氮同時還產生廣譜抗生素的抑制因子，抑制其他微生物生長，該抑菌固氮菌會造成土壤中的微生物單一化，不適合制成復合菌劑。不具有抑制其他微生物生長的固氮菌(簡稱非抑菌固氮菌)在固氮同時不會抑制其他微生物生長，適合制成復合菌劑。

目前篩選固氮菌的方法通常采用蒸餾-中和滴定法和分光光度法測定發酵產物中氨氮的含量，步驟繁瑣，并且不能檢測該固氮菌是否具有抑制其他微生物生長的特性。因此，需要一種能夠檢測固氮菌是抑菌固氮菌，還是非抑菌固氮菌的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測非抑菌固氮菌的方法，能夠快速準確地檢測出土壤中是否含有非抑菌固氮菌。

為了實現上述目的，本發明提供一種檢測非抑菌固氮菌的方法，該方法包括以下步驟：

(1)獲取土壤樣本，將所述土壤樣本接種于Ashby固體培養基中培養；

(2)如果步驟(1)的培養結果是未出現單菌落，則所述土壤樣本中不含有固氮菌；如果步驟(1)的培養結果是出現單菌落，則挑取部分或全部所述單菌落分別進行劃線培養，分離獲得多個單菌株；

(3)挑取所述多個單菌株中的一個單菌株接種于Ashby液體培養基中，進行發酵培養，獲得發酵液；

(4)去除所述發酵液中的菌株，獲得去除該菌株的發酵液；

(5)將指示菌接種于種子培養基中進行培養，獲得所述指示菌；

(6)將所述指示菌接種于有氮源的葡萄糖銨鹽培養基中，并向部分有氮源的葡萄糖銨鹽培養基中加入步驟(4)獲得的所述去除菌株的發酵液，進行培養，分別獲得有氮源不加該發酵液的培養液以及有氮源加該發酵液的培養液；

(7)重復步驟(3)-步驟(6)；

(8)對所有的有氮源不加該發酵液的培養液和所有的有氮源加該發酵液的培養液中的所述指示菌的生物量進行檢測，根據所述生物量的大小判斷所述土壤樣品中是否含有非抑菌固氮菌。

如果土壤樣品結成塊狀，則需要先對土壤樣品進行研磨粉碎，以便于接種。

具體地，在步驟(8)中，根據所述生物量的大小判斷所述土壤樣品中是否含有非抑菌固氮菌包括：

如果部分或者所有的有氮源加該發酵液的培養液的OD₆₀₀值大于所有的有氮源不加該發酵液的培養液的OD₆₀₀值，則所述土壤樣本中含有非抑菌固氮菌。