[發(fā)明專利]一種用于單細(xì)胞測序的膀胱尿路上皮單細(xì)胞懸液的制備方法及應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN110592002B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 史本康;劉亞驍;李巖
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 鄭平

本發(fā)明提供一種用于單細(xì)胞測序的膀胱尿路上皮單細(xì)胞懸液的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述制備方法包括將處死后的動物進(jìn)行全身血液灌注，將采集到的膀胱進(jìn)行孵育、酶解消化即獲得單細(xì)胞懸浮液。本發(fā)明制備得到膀胱尿路上皮單細(xì)胞懸液在保證細(xì)胞質(zhì)量的同時，還可一次性獲得大量分離的尿路上皮細(xì)胞。另外，本發(fā)明所述方法不需要高度專業(yè)化的設(shè)備、試劑或技能，便于研究人員進(jìn)行操作，因此具有良好的實際應(yīng)用之價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于單細(xì)胞測序的膀胱尿路上皮單細(xì)胞懸液的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

本發(fā)明背景技術(shù)中公開的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

哺乳動物的膀胱就像一個空心球體，由尿路上皮、固有層、逼尿肌和漿膜組成(圖1A)。尿路上皮是一種特殊的層狀上皮，至少由傘狀細(xì)胞、中間細(xì)胞和基底細(xì)胞三種細(xì)胞類型組成(圖1B)。這些細(xì)胞通過產(chǎn)生和維持結(jié)晶體斑塊而充當(dāng)尿路屏障。不同的細(xì)胞類型可以用特定的標(biāo)記物來區(qū)分。Krt20標(biāo)志著成熟的傘細(xì)胞，也同時表達(dá)UpkⅠa、UpkⅠb、UpkⅡ、UpkⅢa和UpkⅢb。基底細(xì)胞包括krt5標(biāo)記的基底細(xì)胞和krt14標(biāo)記的基底細(xì)胞，不表達(dá)Krt20和Upk。中間細(xì)胞表達(dá)Upk，不表達(dá)Krt20和Krt5(圖1C)。

近年來，基于微流體的單細(xì)胞測序技術(shù)已被成功地用于了解一些正常組織中的復(fù)雜亞群及癌癥。這項技術(shù)允許在單個細(xì)胞水平上研究分子差異并重建譜系層次結(jié)構(gòu)，使相關(guān)研究人員能夠解決有關(guān)尿路上皮細(xì)胞類型和亞型生物學(xué)的基本問題。然而由于單細(xì)胞測序需要大量的分離的、活性高(存活率90％以上)的細(xì)胞，因此，目前大多數(shù)研究尿路上皮細(xì)胞的方法，無論是分離新鮮細(xì)胞還是獲得原代培養(yǎng)細(xì)胞，都不適合用于單細(xì)胞測序。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種用于單細(xì)胞測序的膀胱尿路上皮單細(xì)胞懸液的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明所述方法可以在保證細(xì)胞質(zhì)量的同時，一次性獲得大量分離的尿路上皮細(xì)胞。此外，這種方法不需要高度專業(yè)化的設(shè)備、試劑或技能，因此具有良好的實際應(yīng)用之價值。

本發(fā)明的第一個方面，提供一種用于單細(xì)胞測序的膀胱尿路上皮單細(xì)胞懸液的制備方法，所述制備方法包括將處死后的動物進(jìn)行全身血液灌注，從而有利于后續(xù)獲得純粹的膀胱上皮細(xì)胞，將采集到的膀胱進(jìn)行孵育、酶解消化即獲得單細(xì)胞懸浮液。

其中，所述全身血液灌注具體方法包括向動物左心室內(nèi)注入D-PBS溶液，D-PBS溶液進(jìn)入體循環(huán)后，肝臟顏色由深變淺；當(dāng)血液從右心耳流出時，打開左心耳，繼續(xù)注入D-PBS溶液，直至肺完全變白或接近完全變白；觀察到膀胱褪色則全身血液灌注成功。由于來自血液細(xì)胞的蛋白質(zhì)會污染尿路上皮的RNA或蛋白質(zhì)，因此為了獲得純粹的膀胱上皮細(xì)胞，本發(fā)明采用動物全身血液灌注方法，而非選擇紅細(xì)胞裂解液來消除紅細(xì)胞的干擾。

其中，所述動物包括哺乳動物，進(jìn)一步包括嚙齒動物，所述嚙齒動物包括但不限于小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠，進(jìn)一步優(yōu)選為小鼠。

所述膀胱孵育、酶解消化具體方法為：

S1、將采集并處理后的膀胱使用dispase II溶液進(jìn)行孵育處理；然后使用PBS-EDTA溶液沖洗2～3次；

S2、使用PBS-EDTA溶液孵育經(jīng)步驟S1處理后的膀胱；

S3、收集步驟S2中的孵育處理后的PBS-EDTA溶液，離心，取上清液加入胰蛋白酶消化細(xì)胞。

本發(fā)明的第二個方面，提供上述制備方法制備得到的膀胱尿路上皮單細(xì)胞懸液。采用本發(fā)明制備方法得到的膀胱尿路上皮單細(xì)胞懸液，其中膀胱尿路上皮單細(xì)胞活性高，品質(zhì)好，且細(xì)胞分離度較高，有利于進(jìn)行單細(xì)胞測序。

本發(fā)明的第三個方面，提供上述制備方法和/或上述膀胱尿路上皮單細(xì)胞懸液在單細(xì)胞測序中的應(yīng)用。