[發明專利]一種用于單細胞測序的膀胱尿路上皮單細胞懸液的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201910959271.2
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN110592002B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 史本康;劉亞驍;李巖
• 申請（專利權）人: 山東大學齊魯醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 鄭平

1.一種用于單細胞測序的膀胱尿路上皮單細胞懸液的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括將處死后的動物進行全身血液灌注，將采集到的膀胱進行孵育、酶解消化即獲得單細胞懸浮液；

所述全身血液灌注具體方法包括：向動物左心室內注入D-PBS溶液，D-PBS溶液進入體循環后，肝臟顏色由深變淺；當血液從右心耳流出時，打開左心耳，繼續注入D-PBS溶液，直至肺完全變白或接近完全變白；觀察到膀胱褪色則全身血液灌注成功；

所述膀胱孵育、酶解消化具體方法為：

S1、將采集并處理后的膀胱使用dispase II溶液進行孵育處理，所述dispase II溶液的濃度為2 mg/ml，溶劑采用DMEM培養基，所述孵育處理條件為：在37℃條件下孵育1.5h；然后使用PBS-EDTA溶液沖洗3次；

S2、使用PBS-EDTA溶液孵育經步驟S1處理后的膀胱，孵育處理條件為在冰浴條件下孵育1.5h；

S3、收集步驟S2中的孵育處理后的PBS-EDTA溶液，離心，取上清液加入胰蛋白酶消化細胞；離心轉速控制為300g，離心處理時間為5min；酶解處理時間控制為1min；

所述制備方法還包括將孵育、酶解消化后的細胞懸液進行酶解消化中和、過濾、離心和重懸；

所述酶解消化中和的緩沖溶液為D-PBS緩沖溶液，其中含有0.04%BSA；

所述過濾采用細胞過濾器進行過濾；所述過濾方法具體為依次使用70μm細胞過濾器和40μm細胞過濾器進行過濾；

所述離心的轉速控制為300g，離心處理時間為5min。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述動物包括哺乳動物。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述動物包括嚙齒動物，所述嚙齒動物包括小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述嚙齒動物為小鼠。

5.如權利要求1-4任一項所述制備方法，其特征在于，所述制備方法各步驟在無菌條件下進行；或，所述制備方法自步驟S2開始，所有步驟均在冰上操作完成。

6.權利要求1-5任一項所述制備方法在單細胞測序中的應用。