[發明專利]一種β-乳球蛋白兔多克隆抗體的制備方法及免疫分析方法

在審

• 申請號: 201910958648.2
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN112646028A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 王世杰;朱宏
• 申請（專利權）人: 石家莊君樂寶乳業有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06;G01N33/68;G01N33/58;G01N33/545;G01N33/531
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 郭樂

本發明提供了一種β?乳球蛋白兔多克隆抗體的制備方法及免疫分析方法，所述制備方法主要過程為β?乳球蛋白直接免疫新西蘭大耳白兔，經過五次免疫后股動脈取全血，獲得β?乳球蛋白抗體血清；通過優化抗體包被量，抗體的稀釋倍數，樣品緩沖溶液的pH值建立β?乳球蛋白間接競爭ELISA方法。本發明制備的抗體效價較高，建立的方法靈敏度和特異性較好。

技術領域

本發明屬于大分子蛋白免疫技術領域，尤其是涉及一種β-乳球蛋白兔多克隆抗體的制備方法及免疫分析方法。

背景技術

β-乳球蛋白目前是乳清蛋白中過敏原所占比例最高的，在牛奶中含量約為4.0mg/mL。它是一個多肽鏈，在鮮牛乳中，以相對分子量為36000的二聚體存在，其單體包含162個氨基酸殘基，單體分子量約為18kDa，等電點為5.1-5.3。

約有80％的人口會出現與β-乳球蛋白相關的食物過敏。它不存在于母乳中，且胃蛋白酶不能將其消化水解，因此可通過胃腸道進入血液循環，具有強致敏性，作為牛乳中的首要過敏成分，刺激嬰兒免疫系統的發生超敏反應。現有的β-乳球蛋白多為單克隆抗體，對多克隆抗體的研究較少，有必要研發一種多克隆抗體，以提高抗體的靈敏度以及特異性。

發明內容

有鑒于此，本發明旨在提出一種β-乳球蛋白兔多克隆抗體的制備方法及免疫分析方法，以提高抗體的靈敏度以及特異性。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種β-乳球蛋白兔多克隆抗體的制備方法，包括免疫過程、抗體純化過程兩個步驟；

其中所述免疫過程中，免疫動物選擇兔子，免疫原為β-乳球蛋白，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初次免疫后進行若干次加強免疫，每次加強免疫7-10天后取血測定抗血清效價，最后一次免疫后7-10天后對動物取全血，收集血清，凍存備用。所述抗體純化過程，是使用純化柱與蛋白純化儀實現的。

優選的，所述免疫過程中，初次免疫后進行四次加強免疫，加強免疫分別于初次免疫后第2、4和6和8周，5次免疫7-10天后采用股動脈取全血，進行保存。

優選的，所述免疫過程具體包括如下步驟：

1)初次免疫：免疫原與弗氏完全佐劑以1：1等體積混合，經密封性良好的玻璃注射器乳化充分，直到免疫原與佐劑完全混勻并呈乳白色狀態為止，免疫劑量為1mg/只；

2)加強免疫：免疫原和弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，進行動物免疫，免疫劑量為0.5mg/只；

3)免疫完成時將采集到的血液先在室溫下凝固2h，然后保存于4℃冰箱中，使血塊收縮，待血清析出后，收集分裝存于-20℃備用。

優選的，所述抗體純化過程，具體包括如下步驟：

1)將實驗中所需的所有緩沖液和溶劑超聲20min以排除氣泡；

2)平衡純化柱：先用pH 7.4的磷酸緩沖液沖洗管路1-2min，流速設定為5-8mL/min。讓純化柱內乙醇自行流出后，將純化柱與蛋白純化儀連接好，用pH 7.4的磷酸緩沖液沖洗柱子，流速設定為0.5-1.5mL/min。觀察程序屏幕中紫外和電導兩條基線變為平行線，即可停止沖柱；

3)上樣：取0.5-1.5mL待純化的抗血清，10000rpm離心10min，溫度設定為4℃；上清液過0.45μm的水膜，過膜后的血清后與磷酸緩沖液等體積稀釋后上柱，在血清樣即將進柱的時候，調整流速設置為0.2-0.8mL/min。抗血清中的免疫球蛋白特異性吸附在ProteinA－Sepharose 4B的結合位點上，而其他蛋白脂肪等雜質不會被吸附，隨緩沖液流出，純化儀紫外電導圖中會顯示出雜蛋白峰；