[發(fā)明專利]一種β-乳球蛋白兔多克隆抗體的制備方法及免疫分析方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910958648.2
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN112646028A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設計）人: 王世杰;朱宏
• 申請（專利權）人: 石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06;G01N33/68;G01N33/58;G01N33/545;G01N33/531
• 代理公司: 天津合正知識產(chǎn)權代理有限公司 12229
• 代理人: 郭樂

1.一種β-乳球蛋白兔多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括免疫過程和抗體純化過程兩個步驟；

其中免疫過程具體方法為：免疫動物選擇兔子，免疫原為β-乳球蛋白，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初次免疫后進行4次加強免疫，分別位于初次免疫后第2、4、6和8周，第5次免疫后采7-10天取全血，收集血清，凍存?zhèn)溆茫?/p>

抗體純化過程，具體包括如下步驟：

1)將該實驗中需要用到的所有緩沖液和溶劑都超聲10-30min以排除氣泡；

2)平衡純化柱：首先用pH 7.4的磷酸緩沖液沖洗管路1-2min，流速設定為5.0-8.0mL/min。沖洗管路后讓純化柱內乙醇自行流出，然后將純化柱與蛋白純化儀連接好，用pH 7.4的磷酸緩沖液沖洗柱子，流速設定為0.5-1.5mL/min；觀察程序屏幕中紫外和電導兩條基線變?yōu)槠叫芯€時，停止沖柱；

3)上樣：取0.5-1.5mL待純化的β-乳球蛋白多克隆抗體血清與磷酸緩沖液等體積稀釋后上柱，調整流速設置為0.3-0.8mL/min。純化儀紫外電導圖中會顯示出雜蛋白峰；

4)洗脫：出現(xiàn)雜蛋白峰后，繼續(xù)用磷酸緩沖液沖洗柱子，至基線達到平衡后停止。然后用pH 2.7的甘氨酸-鹽酸緩沖液沖洗柱子，流速0.3-0.8mL/min，此時與Protein A-Sepharose 4B結合的免疫球蛋白被洗脫下來；

5)收集：加入洗脫液后，注意儀器紫外電導圖線的變化，當基線開始發(fā)生變化時開始收集洗脫液，每個收集管收集約1mL液體，直至曲線不發(fā)生變化，停止收集；收集液經(jīng)分光光度計280nm處讀數(shù)，棄去吸光度值0.4的收集液，將吸光度值0.4的液體混勻后立即用Tris-HCl迅速調節(jié)抗體，使其pH至7.0；

6)處理純化柱：待抗體純化結束后，用0.05-0.20mol/L醋酸迅速沖洗柱子1-3min，流速3-8mL/min，然后再用磷酸鹽緩沖液平衡柱子，同時用pH試紙測定流出緩沖液的pH值，直到其顯示中性為止。最后用質量濃度為20％乙醇溶液沖洗純化柱20min，并使柱子中充滿20％乙醇溶液，封存于4℃；

7)抗體保存方法：將純化后的β-乳球蛋白抗體倒入超濾裝置中進行超濾，重復2-3次，最后一次在液體剩余大概4-5mL時停止超濾，取出液體用分光光度計測定吸光度，與等體積的丙三醇混勻，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

所述免疫過程具體包括如下步驟：

1)初次免疫：免疫原與弗氏完全佐劑以1:1的體積混合，經(jīng)密封性良好的玻璃注射器乳化，進行動物免疫，免疫劑量為1mg/只；

2)加強免疫：免疫原和弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，進行動物免疫，免疫劑量為0.5mg/只；

3)免疫完成采集的全血先放至室溫凝固，后放入4℃冰箱，待血清析出后，收集上清，分裝存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>