[發(fā)明專利]惡臭假單胞菌KT2440蛋白同源表達載體的構建及表達、純化方法

在審

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• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN110592132A
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發(fā)明（設計）人: 崔格特
• 申請（專利權）人: 武漢博歐特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/78
• 分類號: C12N15/78;C12N15/31;C07K14/21;C07K1/22
• 代理公司: 42247 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 張文俊

本發(fā)明公開了一種惡臭假單胞菌KT2440蛋白同源表達載體的構建及表達、純化方法，首先構建含10×His標簽的表達載體，將目的蛋白基因插入該表達載體中，再將含有目的蛋白的表達載體轉入惡臭假單胞菌KT2440中誘導表達。表達出目的蛋白后，通過親和層析純化的方法獲得純目的蛋白，蛋白酶切除10×His標簽，獲得純目的蛋白。本發(fā)明提出的蛋白表達載體，使得惡臭假單胞菌KT2440中無法通過異源表達的蛋白得到純化。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及惡臭假單胞菌KT2440蛋白同源表達載體的構建及表達、純化方法。

背景技術

惡臭假單胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)是重要的模式環(huán)境微生物菌株，其基因組在2002年被解析，也是第一個被美國衛(wèi)生部重組DNA委員會認定對環(huán)境安全的革蘭氏陰性菌株，惡臭假單胞菌KT2440具有廣泛的代謝多樣性和對不同環(huán)境的強適應性。自被分離發(fā)現(xiàn)以來，惡臭假單胞菌KT2440作為模式菌株經常被用于通用的基礎代謝途徑的研究，除此之外，惡臭假單胞菌KT2440及其衍生菌株還被廣泛地應用于各種生物技術應用中。表達和純化蛋白是研究細菌代謝機理和基因功能的重要過程。目前使用的惡臭假單胞菌KT2440蛋白表達純化方法為異源表達法，通過特定載體在大腸桿菌中表達目的蛋白，但使用該方法時常會出現(xiàn)蛋白不能正確折疊而形成包涵體沉淀，造成后續(xù)蛋白難純化的問題。

根據(jù)目前常用的實驗技術，若異源表達的過程中出現(xiàn)包涵體現(xiàn)象，即目的蛋白不可溶或可溶性極差，則需要花費大量精力和時間優(yōu)化蛋白誘導條件，或更換表達載體和融合標簽。如果仍不能解決包涵體問題，則需要進行一系列復雜的操作將蛋白變性和復性，此過程同樣需要花費大量時間和精力，而且難以保證最終得到的目的蛋白具有正常的結構和活性。同源表達較之異源表達，可有效避免目的蛋白在分泌過程中形成包涵體的問題，然而目前并沒有揭示直接在惡臭假單胞菌KT2440中同源表達蛋白并純化的方法。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明提出了一種惡臭假單胞菌KT2440蛋白同源表達載體的構建及表達、純化方法，在惡臭假單胞菌KT2440中原位表達蛋白，避免了蛋白表達過程中出現(xiàn)包涵體，既而進行優(yōu)化蛋白誘導條件或是將其變性再復性等一系列花費大量時間的操作，方便快捷，蛋白表達純化效果好。

本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：

一方面，本發(fā)明提供了一種惡臭假單胞菌KT2440蛋白同源表達載體的構建方法，包括如下步驟：

S1、合成編碼10×His及Thrombin蛋白酶識別位點的序列，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，并構建表達載體pVLT33-10×His；

S2、擴增目的蛋白X的基因x，將基因x連接到表達載體pVLT33-10×His上，得到表達載體pVLT33-10×His-x。

在以上技術方案的基礎上，步驟S1中，在構建所述表達載體pVLT33-10×His過程中，在編碼10×His及Thrombin蛋白酶識別位點的序列上帶上翻譯起始密碼子序列ATG。

在以上技術方案的基礎上，所述表達載體pVLT33-10×His的完整核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在以上技術方案的基礎上，所述表達載體pVLT33-10×His中在編碼10×His及Thrombin蛋白酶識別位點的序列的下游有多克隆位點，用于插入目的基因，根據(jù)目的基因堿基數(shù)目插入到合適酶切位點之間，使得目的蛋白能夠表達。

另一方面，本發(fā)明提供了一種惡臭假單胞菌KT2440蛋白的表達方法，包括：將采用上述方法制備的表達載體pVLT33-10×His-x轉入惡臭假單胞菌KT2440中誘導表達，得到融合蛋白10×His-X。