[發明專利]一種用于觀察細菌蛋白定位的表達載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201910955767.2
• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN110656119B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 崔格特
• 申請（專利權）人: 武漢博歐特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/78;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/02;C12R1/19;C12R1/40
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 張文俊

1.一種用于觀察細菌蛋白定位的表達載體，包括誘導型表達元件、綠色熒光蛋白gfp基因、接合轉移位點、多克隆位點和編碼目的蛋白的基因，其特征在于：所述綠色熒光蛋白gfp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述編碼目的蛋白的基因插入在所述多克隆位點中，所述目的蛋白包括僅在細菌生長特定階段表達的蛋白；

所述用于觀察細菌蛋白定位的表達載體的構建方法，包括如下步驟：

S1、以pBBR1MCS-5質粒為模板，反向擴增得到pBBR1MCS-5上除去lacZ基因以外的DNA片段；

S2、以pVLT33質粒為模板，擴增得到lacI基因+tac啟動子；

S3、用限制性內切酶對步驟S1所述DNA片段和步驟S2所述lacI基因+tac啟動子進行酶切，然后連接得到表達載體pBBRlacITac；

S4、以pBBR1-gfp質粒為模板，擴增得到gfp基因；

S5、用限制性內切酶對表達載體pBBRlacITac和gfp基因進行酶切，然后連接得到表達載體pBBRlacITac-gfp；

S6、以細菌基因組總DNA為模板，擴增得到編碼目的蛋白的基因x；

S7、將編碼目的蛋白的基因x連接到表達載體pBBRlacITac-gfp上，得到表達載體pBBRlacITac-x-gfp。

2.如權利要求1所述的用于觀察細菌蛋白定位的表達載體，其特征在于：所述誘導型表達元件由tac啟動子和lacI操縱基因組成，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.如權利要求1所述的用于觀察細菌蛋白定位的表達載體，其特征在于：所述多克隆位點位于誘導型表達元件和gfp基因之間。

4.如權利要求1所述的用于觀察細菌蛋白定位的表達載體，其特征在于：所述表達載體pBBRlacITac-gfp的完整核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.如權利要求1所述的用于觀察細菌蛋白定位的表達載體，其特征在于：步驟S3中所述限制性內切酶為XhoI和NdeI，步驟S5中所述限制性內切酶為XhoI和HindIII。

6.如權利要求1所述的用于觀察細菌蛋白定位的表達載體，其特征在于：所述編碼目的蛋白的基因x序列中不含翻譯終止密碼子，擴增所述gfp基因時在其末端引入翻譯終止密碼子。

7.如權利要求1所述的用于觀察細菌蛋白定位的表達載體在細菌蛋白空間定位的檢測中的應用，其特征在于：將所述表達載體導入細菌中誘導表達，然后在熒光顯微鏡下觀察細菌細胞中綠色熒光的分布情況來確定目的蛋白的空間定位。