[發明專利]一種用于觀察細菌蛋白定位的表達載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201910955767.2
• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN110656119B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 崔格特
• 申請（專利權）人: 武漢博歐特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/78;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/02;C12R1/19;C12R1/40
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 張文俊

本發明公開了一種用于觀察細菌蛋白定位的表達載體及其構建方法。首先構建含有誘導型tac啟動子和綠色熒光蛋白gfp基因的表達載體，將目的蛋白基因插入該載體中，使目的蛋白和綠色熒光蛋白GFP融合表達，再將此載體轉入細菌中并誘導表達，通過在熒光顯微鏡下觀察細菌細胞中綠色熒光的分布情況來確定目的蛋白的空間定位。本發明可實現在活體細胞中實時直觀地檢測目的蛋白的空間定位，方便快捷。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用于觀察細菌蛋白定位的表達載體及其構建方法。

背景技術

蛋白質是生命活動的最終執行者，蛋白質亞細胞定位與其功能密切相關，蛋白質在細胞中的正確定位是細胞系統高度有序運轉的前提保障。研究細胞中蛋白質定位的機制和規律，預測蛋白質的亞細胞定位，對于了解蛋白質的性質和功能、了解蛋白質之間的相互作用及探索生命的規律和奧秘具有重要意義。將目的蛋白與熒光蛋白融合，利用熒光蛋白的熒光特性檢測目的蛋白質的空間定位是一種快捷靈敏的研究蛋白質空間定位的方法。綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)在藍色波長光線激發下會發出綠色熒光，這使得綠色熒光蛋白GFP作為標簽蛋白在生物技術領域被廣泛使用。GFP介導的融合蛋白標簽技術是20世紀末興起的一種基于報告基因的重組DNA技術，此標簽技術可應用于細胞內基因表達水平的檢測、蛋白質的細胞內原位示蹤與定位等。

細菌屬于原核生物，其胞內的蛋白定位也有多種情況，如膜上、菌體端點附近、細胞質中、周質空間中等，這些不同的定位與蛋白的功能發揮有密切聯系。目前常見的蛋白質空間定位載體多是針對真核生物細胞設計的，針對原核細胞的蛋白定位載體較少。

發明內容

有鑒于此，本發明提出了一種用于觀察細菌蛋白定位的表達載體及其構建方法，本發明的表達載體除了可以直觀檢測細菌中一般蛋白的空間定位，還適用于表達量低的蛋白、毒性蛋白或細菌生長特定階段表達的蛋白的定位觀察，方便實用。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一方面，本發明提供了一種用于觀察細菌蛋白定位的表達載體，包括誘導型表達元件、綠色熒光蛋白gfp基因、接合轉移位點、多克隆位點和編碼目的蛋白的基因，所述綠色熒光蛋白gfp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述編碼目的蛋白的基因插入在所述多克隆位點上，所述目的蛋白包括僅在細菌生長特定階段表達的蛋白。

在以上技術方案的基礎上，優選的，所述誘導型表達元件由tac啟動子和lacI操縱基因組成，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在以上技術方案的基礎上，所述多克隆位點位于誘導型表達元件和gfp基因之間，即目的蛋白基因位于誘導型表達元件和gfp基因之間，實現目的蛋白與GFP蛋白的融合表達。

第二方面，本發明提供了一種用于觀察細菌蛋白定位的表達載體的構建方法，包括如下步驟：

S1、以pBBR1MCS-5質粒為模板，反向擴增得到pBBR1MCS-5上除去lacZ基因以外的DNA片段；

S2、以pVLT33質粒為模板，擴增得到lacI基因+tac啟動子；

S3、用限制性內切酶對步驟S1所述DNA片段和步驟S2所述lacI基因+tac啟動子進行酶切，然后連接得到表達載體pBBRlacITac；

S4、以pBBR1-gfp質粒為模板，擴增得到gfp基因；

S5、用限制性內切酶對表達載體pBBRlacITac和gfp基因進行酶切，然后連接得到表達載體pBBRlacITac-gfp；

S6、以細菌基因組總DNA為模板，擴增得到編碼目的蛋白的基因x；

S7、將編碼目的蛋白的基因x連接到表達載體pBBRlacITac-gfp上，得到表達載體pBBRlacITac-x-gfp。