[發明專利]色氨酸2,3雙加氧酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910955751.1
• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN110628736B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 王喜慶;魏研欣;蔣勝勝
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/18;C12R1/19
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 王玉

本發明公開了一種色氨酸2,3雙加氧酶突變體及其制備方法和應用，屬于蛋白質工程領域。本發明色氨酸2,3雙加氧酶突變體由色氨酸2,3雙加氧酶的氨基酸序列在第51位和第127位進行突變得到。本發明構建的生物催化劑可以利用不帶有保護基的色氨酸、5?氯色氨酸和6?氯色氨酸作為底物，一步合成3a?羥基六氫吡咯[2,3?b]吲哚?2?羧酸（HPICs）及其衍生物。該新型酶將色氨酸雙加氧酶轉化為單加氧酶，其產生HPICs的量遠遠大于野生型色氨酸2,3雙加氧酶產生HPICs的量，具有優秀非對映選擇性；反應和純化過程均在環保的水溶液中，在室溫下進行，反映體系簡單，反應條件溫和，低能耗。

技術領域

本發明涉及一種色氨酸2,3雙加氧酶突變體及其制備方法和應用，屬于蛋白質工程領域。

背景技術

三元環的3a-羥基六氫吡咯 [2,3-b]吲哚-2-羧酸及衍生物（簡稱HPICs）是許多生物堿和多肽類中常見的分子骨架，具有強大的結構多樣性和生物活性。例如，kapakahine C對P388小鼠白血病細胞具有細胞毒性；NWG家族中大部分天然產物(如NWG01)對革蘭氏陽性菌的抗菌活性強于對革蘭氏陰性菌的抗菌活性。除了抗菌活性外，himastatin和chloptosin還能抑制幾種癌細胞系的生長。因此，含有HPICs結構單元的天然產物是合成和藥理學研究的熱門目標。HPIC還可以被氧化成pyrrolobenzoxazine合成中有用的中間體，例如：paeciloxazine、CJ12662 和 CJ12663。此外，具有HPICs骨架的單環肽可以利用酶法轉化為生物活性提高的雙環肽。因此，HPICs除了存在于各種各樣的生物活性分子中，它也是重要的合成中間體。

由色氨酸衍生物構建HPICs已被成為有機化學合成領域研究的熱點。早先，Danishefsky能夠以游離的Trp為底物，通過3-4步制備非對映選擇性的HPICs，這為合成復雜的天然產物提供了有力策略。這些陽離子引發的環化反應利用N-苯基硒代酞酰亞胺(N-PSP)或N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)等親電試劑來激活吲哚環;然后通過間氯過苯甲酸(mCPBA)或AgNO₃水溶液氧化脫氮，實現氧原子取代活化的雜環原子。與上述分步方法不同，DMDO的氧化可以直接將 Trp 衍生物轉化為 HPICs，但非對映選擇性取決于羧基和胺基的保護基團。如果沒有像三苯甲基(Tr)和叔丁基(tBu)這樣龐大的保護基團，得到的HPIC是1:1非對映體的混合物。最近，自由基引發的環化也被用于從受保護的Trp衍生物逐步制備HPIC。盡管取得了顯著的進步，但是在制備HPIC的過程中需要多個保護基團，這不是一種環保的合成方式。為了解決這一問題，Nakagawa研究者已經嘗試利用光敏通過兩步/一鍋法氧化未受保護的色氨酸，包括被Me₂S還原裂解生成的三環過氧化物。反應過程雖然簡單，但這種方法的立體選擇性很差。此外，不穩定的過氧化物中間體易于迅速分解成N’-甲酰基犬尿氨酸(NFK)。

2011年研究發現，色氨酸2,3雙加氧酶xcTDO可以催化色氨酸通過一步反應生成HPIC，這為產生HPIC提供了一種新思路，但是由于反應主要生成NFK，HPIC產量極低的問題，限制了此酶合成HPICs的應用前景。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種色氨酸2,3雙加氧酶突變體及其制備方法和應用，制備的色氨酸2,3雙加氧酶突變體產生HPICs的量遠遠大于野生型色氨酸2,3雙加氧酶產生HPICs的量，具有優秀非對映選擇性。

為解決上述技術問題，本發明提供一種色氨酸2,3雙加氧酶突變體，含有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。

本發明還提供編碼上述色氨酸2,3雙加氧酶突變體的核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發明還提供包含上述色氨酸2,3雙加氧酶突變體的核苷酸的載體。

本發明還提供表達上述色氨酸2,3雙加氧酶突變體的細胞。