[發明專利]一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法

在審

• 申請號: 201910955272.X
• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN111705115A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 田國忠
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/14;C12N15/11;C12R1/36;C12R1/38;C12R1/46;C12R1/01
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法，涉及分子生物學技術領域，涉及待檢樣品中細菌性病原體核酸DNA的巢式PCR檢測技術，通過對巢式PCR擴增產物的測序，鑒定細菌性病原體種類?；?6S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法，靈敏性高，適用范圍廣，適用所有的目前已命名的細菌性微生物的檢測與鑒定，該發明操作簡單，費用低。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，本發明涉及檢測和鑒定待檢測樣品中(如：乳汁，水和組織液等)細菌性微生物核酸DNA的巢式PCR技術方法，通過對PCR擴增產物的測序，鑒定細菌性微生物的種類。

背景技術

16SrDNA其序列包含10個可變區(variable region)和與之相間的11個恒定區(constant region)，可變區因細菌而異，且變異程度與細菌的系統發育密切相關，因此，16SrDNA可以作為細菌菌落結構分析最常用的系統進化標記分子。利用16S rDNA可變區與恒定區的特性，可以進行不同種屬細菌的分類和鑒定。

PCR檢測是運用聚合酶鏈反應擴增出細菌DNA片段，測序，進行核苷酸序列分析，從而定性的判斷細菌的類別。該方法是將16SrDNA作為靶基因，設計引物，該引物只擴增細菌16SrDNA。對病毒及人類白細胞DNA均不擴增。關于16SrDNA常用引物和探針，當提取的DNA可能受損時，稍短的靶序列效果會更好；當樣本中細菌含量豐富時，長的靶序列更合適，通常較長的靶序列能提供更多的可變序列，利于更準確的鑒定，另外不同的PCR引物對，擴增效率不同。因此選擇引物對之前，要對引物進行測試和評估，以判斷其能否用于診斷，

目前讀取序列的準確性也非常高，出現一個操作錯誤的概率為0.01％-0.02％，在這種錯讀水平下不影響細菌的鑒定結果，而且還可以通過正反互補序列測定，對比重疊區域，進行校對，因此產生錯誤序列的幾率非常低。

采用16SrDNA測序方法鑒定細菌時沒有通用的操作指南，序列分析主要依靠序列相似百分率。一般認為相似率99％定義為種，95％一99％則定義為屬，95％則定義為科。

本發明設計普通PCR，引物設計選擇中等長度的核苷酸序列，包括恒定區和可變區，為了提高其靈敏度，選用巢式PCR二次擴增，其產物進行測序，對序列進行比對分析，從而鑒定細菌性微生物的種類。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速、特異的細菌性微生物量核酸DNA檢測與鑒定的巢式PCR檢測方法，本發明的方法用于非疾病診斷。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法，包括以下步驟：

(1)待檢測樣品核酸DNA的提取液，待檢測樣品核酸DNA的提取為從乳汁、水和組織液等待檢測樣品中提取的核酸DNA；

(2)引物對的設計：應用軟件如Primer 5.0軟件分別設計細菌性微生物16S rRNA巢式PCR引物，具體的引物序列包括如下：

第一次PCR擴增引物：

正向引物：F1：5’-TAGCT/GGGTCTGAGAGGATGA-3’，SEQ ID NO：1，其中T/G為兼并性堿基；兼并性堿基T/G采用K指代，即為5’-TAGCKGGTCTGAGAGGATGA-3’；

反向引物：R1：5’-ATGTGTGGCGGGCAGTGT-3’，SEQ ID NO：2；

第二次PCR擴增引物：

正向引物：F2：5’-TACGGGAGGCAGCAGT-3’，SEQ ID NO：3；