[發明專利]一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法

在審

• 申請號: 201910955272.X
• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN111705115A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 田國忠
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/14;C12N15/11;C12R1/36;C12R1/38;C12R1/46;C12R1/01
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

1.一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測與鑒定細菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、待檢測樣品核酸DNA的提取；

(2)、引物對的設計：應用軟件設計巢式PCR引物，具體的引物序列包括如下：

第一次PCR擴增引物：

正向引物：F1：5’-TAGCT/GGGTCTGAGAGGATGA-3’，SEQ ID NO：1，其中T/G為兼并性堿基；

兼并性堿基T/G采用K指代，即為5’-TAGCKGGTCTGAGAGGATGA-3’；

反向引物：R1：5’-ATGTGTGGCGGGCAGTGT-3’，SEQ ID NO：2；

第二次PCR擴增引物：

正向引物：F2：5’-TACGGGAGGCAGCAGT-3’，SEQ ID NO：3；

反向引物：R2：5’-ACTAGCGATTCCGACTTCA-3’，SEQ ID NO：4；

(3)、以步驟1提取的核酸DNA為模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物，通過PCR反應第一次擴增待檢核酸DNA，得到第一次PCR產物的核酸DNA；利用SEQ ID NO:3-4所示引物，通過PCR反應第二次擴增第一次PCR產物的核酸DNA；

(4)檢測并分析PCR擴增產物；

(5)PCR產物測序；

(6)對步驟(5)測序核苷酸序列進行分析，確定細菌性微生物的類型。

2.按照權利要求1所述的一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，待檢測樣品核酸DNA的提取：從包括乳汁，水和組織液等待檢測樣品中提取的核酸DNA。

3.按照權利要求1所述的一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，其中PCR擴增反應：將對應的核酸DNA加入對應的PCR反應混合液中，進行PCR擴增；所述PCR反應混合液，包括：PCR緩沖液10×Buffer，4種dNTP混合物溶液，Taq酶、引物和雙蒸餾水的混合液。

4.按照權利要求2所述的一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，

作為本發明的優選方案：所述的巢式PCR，第一次PCR反應體系包括：PCR緩沖液10×Buffer(Mg²⁺，15mmol/L)2.5μL，4種dNTP混合物溶液2μL，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μL)0.2μL，正向引物F1溶液和反向引物R1溶液各0.4μL(濃度為10μmol/L)，待檢測樣品核酸DNA的提取液4μL，補充雙蒸餾水至25μL體積；

作為本發明的優選方案：所述的巢式PCR，第二次PCR反應體系包括:PCR緩沖液10×Buffer(Mg²⁺，15mmol/L)2.5μL，4種dNTP混合物溶液2μL，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μL)0.2μL，正向引物F2溶液和反向引物R2溶液各0.4μL，第一次PCR擴增產物核酸DNA溶液4μL，補充雙蒸餾水至25μL體積。

5.按照權利要求3所述的一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，各引物溶液的濃度為10μmol/L；dNTP混合物溶液中各NTP即A、T、G和C的濃度均為2.5mmol/L。

6.按照權利要求1所述的一種基于16S rRNA基因設計的巢式PCR檢測細菌性微生物核酸DNA的方法，其特征在于，所述的巢式PCR，第一次PCR反應的條件為：95℃預變性4min；95℃變性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸90sec，30個循環；72℃延伸5min；第二次PCR反應的條件為：95℃預變性4min；95℃變性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸90sec，30個循環；72℃延伸5min。