[發(fā)明專利]一種改良的熒光定量PCR檢測布魯氏菌核酸DNA方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910955250.3
• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN111705147A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田國忠
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京思海天達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

一種改良的熒光定量PCR檢測標(biāo)本中布魯氏菌核酸DNA方法，涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)，熒光定量PCR結(jié)合普通PCR檢測血液標(biāo)本或者其他樣品中布魯氏菌核酸DNA，其靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通PCR和單重的熒光定量PCR方法，可以檢測到一個布魯氏菌核酸DNA拷貝數(shù)，結(jié)果顯而易見，操作簡單，具有普通PCR和熒光定量PCR技術(shù)的人員就可以完成。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及布魯氏菌核酸DNA的PCR技術(shù)方法，通過先行普通PCR擴(kuò)增待檢樣品提取的核酸DNA，再對其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，進(jìn)而檢測與鑒定布魯氏菌核酸DNA的方法。

背景技術(shù)

布魯氏菌病(Brucellosis)簡稱布病，又稱地?zé)嶂泻３趶垷帷ⅠR耳他熱或波浪熱，俗稱“懶漢病”，是由細(xì)胞內(nèi)寄生的布魯氏菌屬(Brucella)細(xì)菌引起的一種人獸共患傳染—變態(tài)反應(yīng)性疾病，布病廣泛分布于世界各地。

目前已知有60多種家畜、家禽、野生動物是布魯氏菌的宿主。與人類有關(guān)的傳染源主要是羊、牛及豬，其次是犬。病畜的分泌物、排泄物、流產(chǎn)物及乳類含有大量病菌，在動物間傳播，造成帶菌或發(fā)病。人通過接觸布病感染的動物、食用布魯氏菌污染的奶制品以及實驗室接觸等傳播方式引起布魯氏菌感染。

布魯氏菌為侵入機(jī)體后，隨淋巴液到達(dá)淋巴結(jié)，被吞噬細(xì)胞吞噬。如細(xì)菌未被吞噬細(xì)胞殺滅，則在胞內(nèi)生長繁殖，形成局部原發(fā)病灶。潛伏期為7-60天，平均15天，少數(shù)患者可達(dá)數(shù)月或1年以上。細(xì)菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)大量繁殖導(dǎo)致吞噬細(xì)胞破裂，隨之大量細(xì)菌進(jìn)入淋巴液和血循環(huán)形成菌血癥。在肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓等處形成多發(fā)性病灶，造成臨床上不僅有菌血癥、敗血癥，而且還有毒血癥的表現(xiàn)。經(jīng)一定時期后，感染灶的細(xì)菌生長繁殖再次入血，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。如此反復(fù)成為慢性感染，慢性期多侵及脊柱和大關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為長期發(fā)熱(包括低熱)、多汗、關(guān)節(jié)痛兼或肝、脾、淋巴結(jié)和睪丸腫大等臨床癥狀及體征。

布魯氏菌常規(guī)檢測方法主要有培養(yǎng)方法和虎紅平板凝集試驗(RBPT)、血清凝集試驗(SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等免疫學(xué)方法。培養(yǎng)中分離到布魯氏菌仍然是布魯氏菌病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但布魯氏菌分離培養(yǎng)的敏感性低、耗時、費力，而且具有較大的生物安全性危害。免疫學(xué)方法目前已經(jīng)用于布魯氏菌病的監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查研究中，但由于在感染早期，機(jī)體還未產(chǎn)生相關(guān)抗體或產(chǎn)生的抗體還未達(dá)到檢測的限度，得到假陰性結(jié)果；而且布魯氏菌與某些細(xì)菌間又存在交叉反應(yīng)，存在著假陽性結(jié)果，影響了檢測的特異性。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR方法(包括普通PCR和熒光定量PCR)已被用于布魯氏菌病的輔助診斷和病原體的檢測中。對待檢樣品中的微量核酸DNA，單一引物的普通PCR和多重PCR方法難以檢測；；熒光定量PCR技術(shù)是一種集PCR技術(shù)、熒光信號檢測和數(shù)據(jù)分析于一體的核酸定性和定量檢測技術(shù)。對純菌DNA具有很高的特異性、靈敏性，準(zhǔn)確性及假陽性率低等特點，可以檢測到2個拷貝數(shù)的核酸DNA，但是目前熒光定量PCR技術(shù)，由于待測樣本如血液中的影響因素眾多，導(dǎo)致假陰性率高，無法做出正確的檢測結(jié)果，影響其布魯氏菌核酸DNA檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明PCR技術(shù)，應(yīng)用熒光定量PCR方法結(jié)合普通PCR技術(shù)方法檢測樣本如血液標(biāo)本或其他標(biāo)本中布魯氏菌核酸DNA，其檢測最低限為1個布魯氏菌核酸DNA拷貝數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種改良的熒光定量PCR檢測布魯氏菌核酸DNA方法。本發(fā)明方法用于非疾病診斷。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種改良的熒光定量PCR檢測布魯氏菌核酸DNA方法，包括以下步驟：

(1)待檢測樣品核酸DNA的提取，能夠提取等標(biāo)本核酸DNA的各種方法都可。

(2)引物的設(shè)計：應(yīng)用軟件分別設(shè)計布魯氏菌特異的引物和探針，具體的引物和探針核苷酸序列包括如下：