[發(fā)明專利]一種改良的熒光定量PCR檢測布魯氏菌核酸DNA方法

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• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN111705147A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發(fā)明（設計）人: 田國忠
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

1.一種改良的熒光定量PCR檢測標本中布魯氏菌核酸DNA方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)待檢測標本核酸DNA的提取；

(2)引物的設計：應用軟件分別設計布魯氏菌特異性引物和探針，具體的核苷酸序列包括如下：

第一次PCR擴增引物：

正向引物：F1：5’-CGAGATGGACGAAACCCATGAAT-3’，SEQ ID NO：1；

反向引物：R1：5’-AGTGGCGTTGATAACCGATTATTT-3’，SEQ ID NO：2；

第二次熒光定量PCR擴增引物和探針：

正向引物：F2：5’-GACAACAGCATGCAGCTTGGTCGTC-3’，SEQ ID NO：3；

反向引物：R2：5’-GCACCATATCGAAAGTCCACGCAGAT-3’，SEQ ID NO：4；

探針：Probe:：5’-TCCACCGCGCGAGCGACCGATGCAGGCAGCTT-3’，SEQ ID NO：5

探針序列：Probe:：SEQ ID NO：5，其中，5`端熒光基團FAM標記，3`端淬滅基團BHQ-1標記；

(3)以步驟(1)提取的核酸DNA為模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物，通過PCR反應第一次擴增核酸DNA，得到第一次PCR產物；利用SEQ ID NO:3-5所示引物及探針，通過熒光定量PCR反應第二次擴增，其模板為第一次PCR產物；

(4)檢測并分析PCR擴增產物；只需要分析熒光定量PCR反應結果即可，反應結束后，陽性對照和陰性對照成立，方可分析標本檢測結果；熒光定量PCR結果，CT值小于28，即標本中存在布魯氏菌核酸DNA。

2.按照權利要求1所述的一種改良的熒光定量PCR檢測標本中布魯氏菌核酸DNA方法，其特征在于，其中PCR擴增反應：將血液標本提取的核酸DNA加到PCR反應混合液中，進行PCR擴增；所述PCR反應體系，包括：PCR反應酶復合物、引物、探針，雙蒸餾水，待測核酸DNA。

3.按照權利要求1所述的一種改良的熒光定量PCR檢測標本中布魯氏菌核酸DNA方法，其特征在于，

第一次PCR反應體系包括：PCR酶復合物12.5μL，正向引物F1和反向引物R1各0.4μL，待檢測樣品核酸DNA 4μL，補充雙蒸餾水至25μL體積。

4.按照權利要求1所述的一種改良的熒光定量PCR檢測標本中布魯氏菌核酸DNA方法，其特征在于，第二次PCR反應體系包括:熒光定量PCR酶復合物10μL，正向引物F2和反向引物R2各0.4μL，探針0.4μL，核酸DNA模板為第一次PCR擴增產物核酸DNA 2μL，補充雙蒸餾水至20μL體積。

5.按照權利要求3或4所述的一種改良的熒光定量PCR檢測標本中布魯氏菌核酸DNA方法，其特征在于，所有引物和探針溶液的濃度均為10μmol/L。

6.按照權利要求1所述的一種改良的熒光定量PCR檢測血液標本中布魯氏菌核酸DNA方法，其特征在于，所述的PCR方法，第一次PCR反應的條件為：95℃預變性4min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30個循環(huán)；72℃延伸5min。

7.按照權利要求1所述的一種改良的熒光定量PCR檢測標本中布魯氏菌核酸DNA方法，其特征在于，PCR方法，第二次熒光定量PCR反應的條件為：95℃預變性3min；95℃變性5sec，60℃退火20sec，40個循環(huán)；退火時采集熒光信號。

8.按照權利要求1所述的一種改良的熒光定量PCR檢測標本中布魯氏菌核酸DNA方法，其特征在于，結果分析，陽性對照和陰性對照成立，待測標本熒光定量PCR的Ct值小于28，即可判斷陽性結果。

9.按照權利要求3或4所述的一種改良的熒光定量PCR檢測標本中布魯氏菌核酸DNA方法，其特征在于，熒光定量PCR酶復合物：Premix Ex Taq TM(Probe qPCR，TaKaRa)。普通PCR酶復合物：2*Ex Taq mastermix,康為世紀生物科技有限公司。