[發(fā)明專(zhuān)利]一種惡臭假單胞菌自殺載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910955182.0
• 申請(qǐng)日: 2019-10-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110551749A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔格特
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 武漢博歐特生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/78
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/78;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/40
• 代理公司: 42247 武漢紅觀專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 張文俊

本發(fā)明公開(kāi)了一種惡臭假單胞菌自殺載體的構(gòu)建方法，并提供了該自殺載體在惡臭假單胞菌中進(jìn)行基因敲除的應(yīng)用方法。首先將pBBR1MCS?5質(zhì)粒的復(fù)制子替換成R6K復(fù)制子，使得其能在大腸桿菌S17/λpir中復(fù)制，而不能在惡臭假單胞菌中復(fù)制，然后在該質(zhì)粒中依次插入待敲除靶基因的上游同源臂、抗生素抗性篩選基因和待敲除靶基因的下游同源臂，從而得到惡臭假單胞菌基因敲除自殺載體。將該自殺載體通過(guò)轉(zhuǎn)化或接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入惡臭假單胞菌中，構(gòu)建待敲除靶基因的缺失突變株。本發(fā)明提出的構(gòu)建惡臭假單胞菌基因缺失突變株的方法，方便快捷，正確率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種惡臭假單胞菌自殺載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

惡臭假單胞菌是一類(lèi)革蘭氏陰性菌，具有廣泛的代謝多樣性和對(duì)不同環(huán)境的強(qiáng)適應(yīng)性，經(jīng)常被用于細(xì)菌基礎(chǔ)代謝途徑的研究，還被廣泛地應(yīng)用于各種生物技術(shù)應(yīng)用中，如污染物的生物修復(fù)和特殊化學(xué)合成物的生產(chǎn)等。基因敲除是菌株遺傳操作的主要方式，也是進(jìn)行基因和蛋白功能研究、闡述生物降解途徑和調(diào)控的主要方法，因此發(fā)展高效、快捷、準(zhǔn)確的基因敲除手段是充分利用惡臭假單胞菌的重要前提。

自殺質(zhì)粒是指一些在某些特定細(xì)菌中自主復(fù)制而在其它細(xì)菌中不能自主復(fù)制的質(zhì)粒，由于大多數(shù)細(xì)菌中不存在復(fù)制基因起始所需的復(fù)制蛋白而無(wú)法復(fù)制，因此，當(dāng)自殺質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，要么不能復(fù)制，被消除，要么在外界選擇性壓力的作用下整合到宿主染色體上，和染色體一起復(fù)制。依據(jù)自殺質(zhì)粒的這一特點(diǎn)，將采用基因工程技術(shù)構(gòu)建的基因突變DNA片段克隆入自殺質(zhì)粒，利用突變基因兩端的同源片段與基因組發(fā)生同源交換，構(gòu)建得到精確的基因缺失突變株，而質(zhì)粒本身由于自殺性特性連同染色體上原有的野生型基因一起隨著細(xì)菌的傳代從菌體中消失。

目前應(yīng)用廣泛的惡臭假單胞菌基因敲除載體為pK18mobsacB，這種傳統(tǒng)自殺載體進(jìn)行基因敲除時(shí)存在一些明顯缺陷，包括：(1)sacB是被廣泛用作自殺載體的致死基因，但sacB所引發(fā)的蔗糖致死效應(yīng)在惡臭假單胞菌中教弱，導(dǎo)致篩選到正確缺失突變株的比例非常低，造成篩選工作量增大；(2)自殺載體本身較大，造成質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的效率低；(3)同源臂連接到一起，進(jìn)行二輪篩選，但由于第二輪交換回復(fù)為野生型的概率非常大，正確率低，常用手段為PCR驗(yàn)證，增加了篩選敲除突變體的成本。因此，當(dāng)用于惡臭假單胞菌基因敲除時(shí)，現(xiàn)有自殺載體表現(xiàn)出明顯的局限性。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提出了一種惡臭假單胞菌自殺載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)高效、快捷、準(zhǔn)確地對(duì)惡臭假單胞菌進(jìn)行基因敲除。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明提出了一種惡臭假單胞菌自殺載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

S1、以pBBR1MCS-5質(zhì)粒為模板，反向擴(kuò)增得到DNA片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

S2、以pTnmod-RKm’質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到R6K復(fù)制子，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

S3、將步驟S1所述DNA片段與步驟S2所述R6K復(fù)制子均用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI進(jìn)行酶切，然后連接得到載體pBR6K；

S4、以惡臭假單胞菌基因組總DNA為模板，擴(kuò)增得到待敲除靶基因x的上游同源臂，然后連到載體pBR6K上，得到載體pBR6K-xup；

S5、以pTnmod-RKm’質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到卡那霉素抗性基因，然后連到載體pBR6K上，得到載體pBR6K-xup-kan；

S6、以惡臭假單胞菌基因組總DNA為模板，擴(kuò)增得到待敲除靶基因x的下游同源臂，然后連到載體pBR6K上，得到載體pBR6K-xup-kan-down；