[發(fā)明專利]一種惡臭假單胞菌自殺載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910955182.0
• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN110551749A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔格特
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢博歐特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/78
• 分類號: C12N15/78;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/40
• 代理公司: 42247 武漢紅觀專利代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 張文俊

1.一種惡臭假單胞菌自殺載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、以pBBR1MCS-5質(zhì)粒為模板，反向擴增得到DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

S2、以pTnmod-RKm’質(zhì)粒為模板，擴增得到R6K復(fù)制子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

S3、將步驟S1所述DNA片段與步驟S2所述R6K復(fù)制子均用限制性內(nèi)切酶NdeI進行酶切，然后連接得到載體pBR6K；

S4、以惡臭假單胞菌基因組總DNA為模板，擴增得到待敲除靶基因x的上游同源臂，然后連到載體pBR6K上，得到載體pBR6K-xup；

S5、以pTnmod-RKm’質(zhì)粒為模板，擴增得到卡那霉素抗性基因，然后連到載體pBR6K上，得到載體pBR6K-xup-kan；

S6、以惡臭假單胞菌基因組總DNA為模板，擴增得到待敲除靶基因x的下游同源臂，然后連到載體pBR6K上，得到載體pBR6K-xup-kan-down。

2.如權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌自殺載體的構(gòu)建方法，其特征在于：所述待敲除靶基因x的上游同源臂和下游同源臂的長度分別為600bp-1000bp。

3.一種利用權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的惡臭假單胞菌自殺載體構(gòu)建惡臭假單胞菌基因缺失菌株的方法，其特征在于：將所述惡臭假單胞菌自殺載體經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入供體菌中，然后將此供體菌與受體菌混合，經(jīng)接合轉(zhuǎn)移將惡臭假單胞菌自殺載體轉(zhuǎn)移進入受體菌，通過卡那霉素和慶大霉素共同篩選，獲得所述待敲除靶基因缺失的菌株。

4.一種利用權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的惡臭假單胞菌自殺載體構(gòu)建惡臭假單胞菌基因缺失菌株的方法，其特征在于：將所述惡臭假單胞菌自殺載體直接轉(zhuǎn)化到惡臭假單胞菌中進行培養(yǎng)發(fā)生同源交換，通過卡那霉素和慶大霉素共同篩選，獲得所述待敲除靶基因缺失的菌株。

5.利用權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的惡臭假單胞菌自殺載體在惡臭假單胞菌的基因敲除中的應(yīng)用。