[發(fā)明專利]一種檢測喹乙醇的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910948273.1
• 申請日: 2019-10-08
• 公開（公告）號: CN111060690B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發(fā)明（設計）人: 金仁耀;王賽賽;翟璐;郭建軍
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學;杭州佰昕科技有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/577;C07K16/44;G01N33/533
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

1.一種檢測喹乙醇的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于，包括以下組成：

（1）包被有1?μg·mL^-1抗原OLA-A-OVA的反應板；-A-表示-CH=CH-CH=CH-COO-；

抗原OLA-A-OVA為：

（2）銪標記的喹乙醇單克隆抗體溶液：含0.5?ng·mL^-1的Eu³⁺-OLA-mAb，質量百分含量為1%BSA，質量百分含量為0.2%疊氮化鈉，基礎緩沖體系為0.01?mol·L^-1，pH=7.4的磷酸鹽緩沖液與等體積的甘油混合而成；

（3）喹乙醇標準品母液1?μg·mL^-1；

（4）反應增強液：含0.27?mmol·L^-1?а-噻吩甲酰三氟丙酮，0.5?mmol·L^-1三辛基氧化膦，體積分數(shù)為0.05%無水乙醇，體積分數(shù)為5.9%冰乙酸，體積分數(shù)為0.25%的TritonX-100，6.8?mmol·L^-1的鄰苯二甲酸氫鉀，pH為3?.0，余量為去離子水；

（5）濃縮洗液：100?mmol·L^-1、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，且該緩沖液中含有體積百分比濃度為0.5%的吐溫20。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測喹乙醇的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于，反應板為96孔板，材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測喹乙醇的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于，銪標記的喹乙醇單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）喹乙醇半抗原的合成

（1.1）將1mmol喹乙醇溶于2-5mLTHF中，?0℃下加入1.0-1.2?mmol?NaH，攪拌0.5-2小時，后加入1mmol?的5-溴-2,4-二烯戊酸乙酯，65℃下反應6-8小時，待反應完全后，加入30-50mL?H₂O，用乙酸乙酯萃取，合并有機相，用飽和食鹽水洗滌，旋干溶劑，經(jīng)柱層析分離得到OLA-A₁，A₁為-CH=CH-CH=CH-COOCH₂?CH₃；

（1.2）將1mmol?OLA-A₁溶于8-12mL甲醇與水的混合液中，其中，甲醇與水的體積比為1:1，加入氫氧化鋰1-1.5mmol，攪拌，室溫下反應1-3h；反應完全后，用1mol/L的鹽酸溶液調節(jié)pH等于5-6，乙酸乙酯萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，再用無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去溶劑，得產物OLA-A，-A為-CH=CH-CH=CH-COOH；具體的合成路線如下：

；

（2）喹乙醇人工抗原的合成

取0.04?mmol?OLA-A溶于0.8?-1.0mL?DMF中，加入0.04?mmol?N-羥基琥珀酰亞胺和0.04?mmol二環(huán)己基碳二亞胺，室溫下避光攪拌反應10-12?h后2000?r/min離心10?min，離心后上清液為a液；

稱取20?mg?OVA溶于5?mL?0.01?mmol/L，pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，此為b液；

4?℃下將0.6?mL?a液逐滴加入到b液中，4?℃攪拌反應過夜；次日轉入透析袋內，0.01mmol/L，pH=7.4的磷酸鹽緩沖液透析2天，離心棄沉淀，得到交聯(lián)產物，命名為OLA-A-OVA，-A-表示-CH=CH-CH=CH-COO-；具體的合成路線如下：

；

（3）小鼠免疫：

選擇6-8周齡BALB/C?雌性小鼠，將制備的免疫原OLA-A-OVA與等體積弗氏完全佐劑采用注射器加壓充分混合乳化后，腹部和腋下多點注射，后每間隔21天進行加強免疫，3次加強免疫后采血測定效價，效價采用間接ELISA方法測定，當效價不再明顯升高時進行末免，末免3?天后進行細胞融合，免疫過程中第一次免疫使用弗氏完全佐劑，加強免疫采用弗氏不完全佐劑，末免不使用佐劑，直接免疫原注射免疫；

（4）細胞融合與細胞株篩選：

在末免3天后，按照常規(guī)PEG方法進行細胞融合，將小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按照5～10：1的比例進行融合，間接ELISA篩選陽性孔，并對陽性孔進一步利用間接競爭ELISA測定陽性孔的抑制效果，對抑制效果好的雜交瘤細胞用有限稀釋法進行3~4次克隆，篩選獲得雜交瘤細胞株；

向BALB/C小鼠腹腔注射降植烷，0.3?mL/只，7～10天后同法注射雜交瘤細胞株細胞，待小鼠腹腔明顯脹大后抽取腹水，離心除去油脂沉淀后，即得小鼠腹水；

腹水純化后，得到抗喹乙醇單克隆抗體；

（5）Eu³⁺-OLA-mAb的制備

A.?5?mL純化好的喹乙醇單克隆抗體與0.5?mL?0.01?mol·L^-1?pH為7.4的磷酸鹽緩沖液?1:1混合；

B．稱取3.0?mg環(huán)化二乙烯三胺五醋酸酐，加入90?μL?DMSO溶解；

C.?將90?μL步驟?B中的溶液緩慢滴加到步驟A中溶液，用0.125?mol·L^-1?NaOH調pH至9.0，室溫避光放置2?h；

D.?將步驟C最終的反應液轉移至透析袋中，0.01?mol·L^-1?pH=7.4?磷酸鹽緩沖液透析過夜；

E.?準確稱取0.242?g?EuCl₃·6H₂O于20?mL水中配成3.3×10^-2?mol·L^-1?EuCl₃溶液；

F.?取100?μL?步驟E中的溶液加入步驟D中，室溫避光反應3?h后置于透析袋中透析24h?~36?h，分裝保存于-20?℃，即得到銪標記喹乙醇單克隆抗體Eu³⁺-OLA-mAb。