[發(fā)明專利]一種通用的食用菌發(fā)酵物料中重要微生物的鑒定方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910942694.3
• 申請(qǐng)日: 2019-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN110551807A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雋加香;高照亮;黃建春;陳明杰;王倩;肖婷婷;陳輝;宋曉霞;張津京
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/04
• 代理公司: 31334 上海段和段律師事務(wù)所
• 代理人: 李慧;郭國中

1.一種通用的食用菌發(fā)酵物料中重要微生物的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、采樣培養(yǎng)：從食用菌二次發(fā)酵料中采集出倉二次料后，進(jìn)行活化；

S2、篩選與純化：將活化后的出倉二次料采用不同培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待菌落半徑擴(kuò)大至1厘米后，再接種進(jìn)行純化培養(yǎng)；

S3、鑒定：將純化培養(yǎng)后的菌落進(jìn)行基因組DNA提取，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物回收后進(jìn)行DNA測(cè)序，并通過比對(duì)即得到各菌落的鑒定結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通用的食用菌發(fā)酵物料中重要微生物的鑒定方法，其特征在于，步驟S1中，所述活化的條件為：將出倉二次料封裝后置于55℃、濕度約為60％的培養(yǎng)箱中活化12小時(shí)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通用的食用菌發(fā)酵物料中重要微生物的鑒定方法，其特征在于，步驟S2中，所述培養(yǎng)基包括PGA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通用的食用菌發(fā)酵物料中重要微生物的鑒定方法，其特征在于，所述PGA培養(yǎng)基的制備為：以1L水的量計(jì)，將蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母粉1.0g，碳酸鈣3g，氯化鈉5g，瓊脂15g溶解在水中，在121℃滅菌20min；

所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備為：以1L水的量計(jì)，將牛肉膏5g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂18.0g溶解在蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH7.0～7.2；121℃滅菌20min；

所述孟加拉紅培養(yǎng)基的制備為：以1L水的量計(jì)，將蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸二氫鉀1.0g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20.0g，孟加拉紅0.033g，氯霉素0.1g溶解在蒸餾水中，121℃滅菌30min；

所述改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基的制備為：以1L水的量計(jì)，將可溶性淀粉20.0g，硝酸鉀1.0g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，氯化鈉0.5g，瓊脂18.0g溶解在蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH7.2-7.4；配制時(shí)將可溶性淀粉先加少量冷蒸餾水調(diào)成糊狀后，再加入沸蒸餾水中；121C，20min滅菌；臨用時(shí)在每300mL培養(yǎng)基中加3％重鉻酸鉀1mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通用的食用菌發(fā)酵物料中重要微生物的鑒定方法，其特征在于，步驟S2中，所述培養(yǎng)基為PGA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)方法如下：

取5至10克出倉二次料浸沒于無菌水中，振蕩后，吸取一定量的出倉二次料浸出液，將浸出液稀釋出10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6六個(gè)濃度梯度，將6個(gè)濃度的菌液分別涂布于PGA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上；

將已涂布有菌液的培養(yǎng)基倒置于55℃、濕度為60％～80％的培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通用的食用菌發(fā)酵物料中重要微生物的鑒定方法，其特征在于，步驟S2中，所述培養(yǎng)基為孟加拉紅培養(yǎng)基、改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)方法如下：

取1.5-2.5厘米的出倉二次料接種在培養(yǎng)基上，倒置于55℃、濕度為70％的培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通用的食用菌發(fā)酵物料中重要微生物的鑒定方法，其特征在于，步驟S3中，所述基因組DNA提取的方法如下：

A、將純化后的菌體加入緩沖液GA中振蕩，得懸浮液；

B、在懸浮液中加入Proteinase K溶液，混勻；

C、向步驟B所得溶液中加入緩沖液GB，振蕩后，放置一段時(shí)間，然后離心去除水珠；

D、向步驟C所得溶液中加入無水乙醇，振蕩搖勻；

E、將步驟D所得混合物加入吸附柱中，離心去除廢液；

F、然后加入緩沖液GD，再離心去除廢液；

G、再加入漂洗液，離心去除廢液；

H、重復(fù)步驟E-G，所得離心液再次離心去除廢液后，室溫放置；

I、向步驟H處理后的吸附柱滴加洗脫緩沖液TE，室溫放置后離心，收集溶液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通用的食用菌發(fā)酵物料中重要微生物的鑒定方法，其特征在于，步驟S3中，所述PCR擴(kuò)增采用的引物對(duì)序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。