[發明專利]一種同步純化脂肪酶、酸性蛋白酶和α-淀粉酶的方法

有效

• 申請號: 201910941211.8
• 申請日: 2019-09-30
• 公開（公告）號: CN110564709B
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發明（設計）人: 蔡志強;張宇;祁荃;郭靜;朱孝霖;楊廣花
• 申請（專利權）人: 上海開鴻環保科技有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N9/50;C12N9/26
• 代理公司: 暫無信息
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本發明屬于蛋白純化領域，具體公開了一種同步純化脂肪酶、酸性蛋白酶、α?淀粉酶的方法。首先采用硫酸銨鹽析的方法確定每種蛋白析出時所對應的硫酸銨飽和度，而后將各梯度的飽和酶液經透析后上柱于Q Beads 6 FF陰離子柱，再用50?400mM的NaCl溶液梯度洗脫，流速控制在1?5mL/min，收集各組分酶液濃縮測定其蛋白含量和酶活，最后進行SDS?PAGE電泳確定純化效果。

技術領域

本發明屬于蛋白純化領域，特別涉及一種同步純化酶粉中脂肪酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶三種蛋白的方法。

背景技術

脂肪酶，是重要的工業酶制劑品種之一，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應用于能源、油脂加工、食品、醫藥等行業領域。自然界中，脂肪酶普遍存在于植物種子、動物組織及微生物中，其中，工業用脂肪酶多源于微生物。因其反應所需條件溫和，催化率高，立體選擇性好，廣泛的底物特異性以及便于提取與潛在的無限供給，所以得到廣大工業領域的普遍使用。

在當今社會，由于食品工業的迅猛發展，消費者的食品安全和健康意識日益增強，對面粉及豆制品的要求越來越高。若想生產好的面粉，就要有優質的原材料,所以需要在食品處理中添加催化酶，酶的催化效率特別高，比普通催化劑高出100倍以上，它不僅能提高面包的烘焙品質，還可以延長制品的保質期。

蛋白酶是可以水解蛋白中的肽鍵并生成氨基酸或小肽的一類酶，是世界三大酶制劑之一，占全球酶制劑銷量的60％，其主要來源于動物、植物和微生物，一般情況下不含有毒有害物質，而且水解反應完全后自身可以被滅活，因此在食品工業中有著廣泛的應用。其中酸性蛋白酶是一種適合于在酸性環境下水解蛋白質的酶類，它主要用于毛皮軟化和脫毛處理，也可用于羊毛低溫染色和啤酒澄清工藝，以及消炎止咳，化痰和助消化。在啤酒澄清過程中需要添加蛋白酶來降解啤酒中的懸浮物，以提高啤酒的澄清度，另外還可以提高底物的利用率，降低成本。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，通常可以通過淀粉酶催化水解織物上的淀粉漿料。由于淀粉酶的高效性以及專一性，酶退漿的退漿率高，污染少，且不損傷纖維。其中α-淀粉酶是目前運用最多的一種水解酶類之一，可用于食品工業、啤酒釀造、發酵、飼料、紡織、酒精工業、烘焙工業、醫藥等許多工業。

純化蛋白的過程中由于各蛋白的特性不一，若想分離出一種目標蛋白，需考慮蛋白分子的帶電性質，溶解度，分子大小以及配體特異性，通常會經過多步層析逐步消除雜蛋白特性的方法來純化。現有技術中沒有同步純化脂肪酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶三種蛋白的方法的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種可同步純化脂肪酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶三種蛋白的方法。通過一步層析法，并結合本發明的反應條件，可同步純化出三種目標蛋白，其操作簡便，僅需一次離子層析便可高效純化三種蛋白，最終使得脂肪酶純化倍數提高63.24倍，酸性蛋白酶10.33倍，α-淀粉酶31.69倍。

為實現上述目的，本發明采用硫酸銨鹽析以及Q Beads 6FF陰離子層析來進行三種蛋白的純化。該蛋白純化技術通過下述步驟進行：

(1)通過硫酸銨鹽析的方法確定三種蛋白析出時所對應的硫酸銨飽和度；

分別將三種酶粉與各自的緩沖液按照1:10(1g酶粉：10mL緩沖液)的比例進行稀釋，混勻后8,000rpm離心5min，在上清液中加入硫酸銨粉末使硫酸銨飽和度達到40％，靜置30min后，8,000rpm再次離心5min，在上清液中再次加入硫酸銨粉末使硫酸銨飽和度達到50％，靜置30min，8,000rpm再次離心5min，上清液補充硫酸銨至60％飽和度，梯度鹽析直至硫酸銨飽和度為90％，最后收集各梯度的上清和沉淀放入透析袋中除鹽。

(2)將5-10倍柱體積鹽析后的酶液上樣于Q柱，流速為1-5mL/min，(上樣前酶液需經0.45μm濾頭過濾除雜。