[發明專利]基因缺失型中間氣單胞菌

有效

• 申請號: 201910940216.9
• 申請日: 2019-09-30
• 公開（公告）號: CN110713963B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 王嬌;徐國東;袁冰
• 申請（專利權）人: 武漢珈創生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 代嬋

本發明公開了一種基因缺失型中間氣單胞菌，其相較于中間氣單胞菌WS基因組中缺少katE基因。相較于野生菌株WS，本發明所提供的基因缺失型中間氣單胞菌，死亡提前發生，并且能夠保持完整的細胞形態，適合作為模型生物研究黑色素形成機制以及作為生物反應器生產黑色素，其作為生物反應器應用于工業化生產中前景良好，無需后續處理，可節約成本，簡化操作。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一種經過遺傳改造的基因缺失型中間氣單胞菌。

背景技術

中間氣單胞菌WS(Aeromonas media WS)是從東湖分離得到的一株高產黑色素菌株，具有色素合成能力強和合成時間短的特性。黑色素通常是由酚類或吲哚類物聚合形成，它是一類疏水性生物大分子。它廣泛存在于動物、植物和微生物中。已有研究表明，黑色素能極大地提高生物生存競爭能力，因此，黑色素的普遍性存在被認為是進化過程中生命與環境長期相互適應的結果。按合成途徑的不同，細菌合成的黑色素通常是真黑色素和膿黑色素。中間氣單胞菌WS主要通過尿黑酸途徑合成膿黑色素，通過研究中間氣單胞菌WS的黑色素合成機制有助于進一步揭示黑色素形成分子機制及生物學功能。

由于缺少比較合適的模型生物，目前對于黑色素的合成和生物學功能研究仍處于初級階段。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中缺少研究黑色素形成分子機制以及生物學功能的生物模型這一問題，提供一種合適的模型生物。

第一方面，本發明提供了一種基因缺失型中間氣單胞菌，相較于中間氣單胞菌WS，其基因組中缺少katE基因。

katE基因編碼的是過氧化氫酶CAT，過氧化氫酶是一類能夠高效清除過氧化氫的末端氧化酶，廣泛存在于動物、植物和微生物體內，它主要是以過氧化氫為底物，通過催化一對電子的轉移而最終將其分解為水和氧氣。而過氧化氫是一類活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)，在生物體內存在適量過氧化氫可以作為第二信使參與細胞的信號轉導通路，引起免疫細胞的激活、細胞增生等；相反，當過氧化氫在細胞中過量累積時，會造成細胞毒性，如蛋白羰基化、DNA損傷等，因此，CAT能夠防止由于ROS水平過高對細胞產生的毒害，并與超氧化物歧化酶、過氧化物酶共同組成抗氧化酶系，從而應答細胞的氧化脅迫。

另外，已有文獻報道發現，在一些物種中黑色素的合成對體內ROS水平的影響，但具體涉及到的催化反應研究仍是沒有涉及。雖已有報道在大腸桿菌中，OxyR作為一個全局性的轉錄調控因子，介導和調控oxyR、kat和ahp基因，并通過其相互協同作用，識別調控過氧化氫，影響菌株整體的生長與繁殖。另有研究者發現缺失OxyR會導致大腸桿菌在平板培養時有生長缺陷。

本發明研究發現，缺少katE基因的中間氣單胞菌WS，黑色素產率明顯降低，且發生提前死亡(培養24h內就會發生提前死亡的現象)，而且死亡后細菌仍然能夠保持完整的細胞形態。缺少katE基因的中間氣單胞菌非常適合作為模型生物，有助于深入研究黑色素的合成和生物學功能。另外，由于該菌的特性，還可以作為生產各類酶制劑的生物反應器，為工業化生產提供新思路。

進一步地，上述基因缺失型中間氣單胞菌，是由中間氣單胞菌WS經過katE基因敲除制備而成。人工遺傳改造操作更加簡便可控。

進一步地，上述基因缺失型中間氣單胞菌，具體制備方法如下：

1)以中間氣單胞菌WS的基因組為模板，設計引物擴增獲得katE基因的上游同源臂和下游同源臂，兩同源臂均帶酶切位點；

2)將上游同源臂和下游同源臂一起連接至攜帶氯霉素抗性基因的自殺性載體pDM4上，轉化到大腸桿菌中，在添加氯霉素的培養基上進行培養，獲得敲除載體；

3)以中間氣單胞菌WS作為受體菌，步驟2)獲得的含敲除載體的大腸桿菌為供體菌，利用二親本接合法將二者混合，在不添加抗生素的培養基中培養，使敲除載體進入受體菌；