[發明專利]基因缺失型中間氣單胞菌有效

申請號：	201910940216.9	申請日：	2019-09-30
公開（公告）號：	CN110713963B	公開（公告）日：	2021-05-18
發明（設計）人：	王嬌;徐國東;袁冰	申請（專利權）人：	武漢珈創生物技術股份有限公司
主分類號：	C12N1/21	分類號：	C12N1/21;C12N15/74;C12P1/04;C12R1/01
代理公司：	北京匯澤知識產權代理有限公司 11228	代理人：	代嬋
地址：	430074 湖北省武漢市東湖開發區高新大道***	國省代碼：	湖北;42
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摘要：
搜索關鍵詞：	基因缺失中間氣單胞菌
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【權利要求書】：

1.一株基因缺失型中間氣單胞菌在工業化生產內切葡聚糖酶中的應用，其特征在于，所述基因缺失型中間氣單胞菌相較于中間氣單胞菌WS，其基因組中缺少katE基因，死亡提前發生，且死亡后細菌仍然能夠保持完整的細胞形態；分類命名為中間氣單胞菌WSΔkatE（Aeromonas media WSΔkatE），于2019年9月10日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，保藏編號為：CCTCC NO: M2019711。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述基因缺失型中間氣單胞菌由中間氣單胞菌WS經過katE基因敲除制備而成，具體制備方法如下：

1）以中間氣單胞菌WS的基因組為模板，設計引物擴增獲得katE基因的上游同源臂和下游同源臂，兩同源臂均帶酶切位點；

2）將上游同源臂和下游同源臂一起連接至攜帶氯霉素抗性基因的自殺性載體pDM4上，轉化到大腸桿菌中，在添加氯霉素的培養基上進行培養，獲得敲除載體；

3）以中間氣單胞菌WS作為受體菌，步驟2）獲得的含敲除載體的大腸桿菌為供體菌，利用二親本接合法將二者混合，在不添加抗生素的培養基中培養，使敲除載體進入受體菌；

4）由于敲除載體上攜帶氯霉素抗性基因，中間氣單胞菌WS基因組上攜帶氨芐青霉素抗性基因，將步驟3）中得到的菌苔稀釋涂布在添加氨芐青霉素及氯霉素的培養基生長，篩選出完成第一次同源交換的菌株；

5）將步驟4）得到的發生第一次同源交換的菌株點種于不添加抗生素的培養基上培養，以利于其進行二次同源交換；

6）將步驟5）得到的單菌落點種于含蔗糖的培養基上培養，篩選出發生二次同源交換的菌株；利用katE基因外圍引物進行PCR檢測katE基因是否被敲除，選取片段大小正確的菌株在不含抗生素的培養基平板上劃線分單菌落；

7）取步驟6）的劃線得到的單菌落進行PCR驗證其基因敲除情況，測序驗證無誤后，此時即成功獲得katE基因敲除菌株。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述培養基的配方為：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉5 g/L和水適量；制備固體培養基時，瓊脂粉添加量為15 g/L；需添加氨芐青霉素時，氨芐青霉素添加量為100 μg/mL；需添加氯霉素時，氯霉素添加量為34 μg/mL。

4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟1）中上游同源臂的正反向擴增引物核苷酸序列如下：

正向引物：SEQ ID NO.1；

反向引物：SEQ ID NO.2。