[發(fā)明專利]一種基于GC-MS技術(shù)的高通量定量分析豬肝臟內(nèi)源代謝物的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910937443.6
• 申請(qǐng)日: 2019-09-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110672740B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 晏石娟;陳莊;黃文潔;孔謙;陳夢(mèng)雨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于GC?MS技術(shù)的高通量定量分析豬肝臟內(nèi)源代謝物的方法，包括樣品前處理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)果鑒定、代謝物的定量分析。本發(fā)明采用有機(jī)溶劑對(duì)豬肝臟樣品進(jìn)行超聲輔助萃取得到全面的代謝物提取物，采用保留時(shí)間和質(zhì)譜譜圖庫(kù)定性GC?MS采集的所有代謝物，共鑒定了64種肝臟內(nèi)源代謝物；隨后采用靶標(biāo)定量分析方法定量分析所鑒定的64種代謝物，該方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，快速可靠，為開(kāi)展肝臟代謝組相關(guān)研究提供了重要的參考。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于GC-MS技術(shù)的高通量定量分析豬肝臟內(nèi)源代謝物的方法。

背景技術(shù)

肝臟是動(dòng)物體代謝的中樞性器官，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝發(fā)揮重要功能。例如它對(duì)于糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝穩(wěn)態(tài)的維持起重要作用。因此，對(duì)豬肝臟內(nèi)源代謝物進(jìn)行系統(tǒng)分析可以有助于深入了解豬機(jī)體代謝流的基本情況，同時(shí)實(shí)時(shí)的揭示肝臟中的代謝物成分以后，不僅有助于對(duì)尚不明確的代謝通路開(kāi)展深入的機(jī)制研究，還可以根據(jù)肝臟代謝特征有針對(duì)性地優(yōu)化飼料的營(yíng)養(yǎng)配方，提高養(yǎng)殖生產(chǎn)效益，從而推進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。目前為止，針對(duì)人肝臟代謝的研究比較多，但對(duì)豬肝臟代謝的研究比較少見(jiàn)，僅有幾篇文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)所用的技術(shù)只能檢測(cè)到少于50種物質(zhì)。

代謝組學(xué)是通過(guò)對(duì)一個(gè)生物系統(tǒng)的細(xì)胞在給定條件下所有內(nèi)源性代謝物質(zhì)進(jìn)行定性定量，進(jìn)而對(duì)其整體及其對(duì)內(nèi)在因素和外在因素變化應(yīng)答的規(guī)律進(jìn)行檢測(cè)的科學(xué)。它是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、以及蛋白質(zhì)組學(xué)后興起的一門(mén)新技術(shù)，亦是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成之一。代謝組學(xué)的檢測(cè)方式主要有核磁共振技術(shù)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。其中氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于其穩(wěn)定性和可重復(fù)性強(qiáng)，在營(yíng)養(yǎng)代謝組學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，為此開(kāi)發(fā)出一種基于GC-MS技術(shù)的高通量定量分析豬肝臟內(nèi)源代謝物的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于GC-MS技術(shù)的高通量定量分析豬肝臟內(nèi)源代謝物的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種基于GC-MS技術(shù)的高通量定量分析豬肝臟內(nèi)源代謝物的方法，包括如下步驟：

S1、肝臟樣品的前處理:將采集的肝臟樣品存放于-196℃的液氮罐中猝滅 30分鐘，終止代謝反應(yīng)，再轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中存放，將從冰箱中取出的肝臟樣品置于研缽中，加入液氮冷凍并研磨成粉末后，裝入15mL離心管中再于 -80℃冰箱中保存留待分析；

S2、肝臟代謝物的萃取:準(zhǔn)確稱量50mg肝臟粉末樣品于2mL的離心管中，加入1mL提取液和20μL ¹³C標(biāo)記-D核糖醇(1mg/mL)作為內(nèi)標(biāo)物，充分混勻樣品，接著使用超聲儀進(jìn)行冰水浴超聲30分鐘，而后在4℃，15000rpm 條件下離心10分鐘，然后吸取200μL上層清液于1.5mL離心管中，在室溫下真空濃縮干燥2小時(shí)得到肝臟代謝物提取物；

S3、代謝物的衍生化處理：往真空濃縮干燥后的樣品中加入50μL甲氧基胺鹽酸鹽(20mg/mL，吡啶溶液)，充分混勻后置于振搖儀上振搖，后再加入100μL硅烷化試劑N-甲基-N三甲基硅烷三氟乙酰胺，充分混勻60秒后置于振搖儀上振搖，反應(yīng)后進(jìn)行離心，并取適量上層清液轉(zhuǎn)移到帶有150μL 內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)待用；

S4、GC-MS檢測(cè)：樣品采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，采用全掃描和選擇離子監(jiān)測(cè)分別進(jìn)行掃描，先用全掃描方式采集數(shù)據(jù)進(jìn)行代謝物定性分析，準(zhǔn)確定性了豬肝臟中的64種物質(zhì)，得到64種物質(zhì)的保留時(shí)間、特征離子碎片，然后根據(jù)保留時(shí)間和特征離子碎片，采用選擇離子監(jiān)測(cè)方式對(duì)64種物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。

優(yōu)選的一種實(shí)施案例，步驟S2中，所述提取液為水、正己烷和氫氧化鈉溶液按體積比(2-4)：(3-5)：(1-3)進(jìn)行均勻混合制成，且氫氧化鈉溶液的濃度為2mol/L。

優(yōu)選的一種實(shí)施案例，所述提取液為水、正己烷和氫氧化鈉溶液按體積比2:4:1進(jìn)行均勻混合制成，且氫氧化鈉溶液的濃度為2mol/L。