[發明專利]一種基于GC-MS技術的高通量定量分析豬肝臟內源代謝物的方法

有效

• 申請號: 201910937443.6
• 申請日: 2019-09-30
• 公開（公告）號: CN110672740B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 晏石娟;陳莊;黃文潔;孔謙;陳夢雨
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院農業生物基因研究中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種基于GC-MS技術的高通量定量分析豬肝臟內源代謝物的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、肝臟樣品的前處理:將采集的肝臟樣品存放于-196℃的液氮罐中猝滅30分鐘，終止代謝反應，再轉移到-80℃冰箱中存放，將從冰箱中取出的肝臟樣品置于研缽中，加入液氮冷凍并研磨成粉末后，裝入15mL離心管中再于-80℃冰箱中保存留待分析；

S2、肝臟代謝物的萃取:準確稱量50mg肝臟粉末樣品于2mL的離心管中，加入1mL提取液和20μL濃度1mg/mL的¹³C標記-D核糖醇作為內標物，充分混勻樣品，接著使用超聲儀進行冰水浴超聲30分鐘，而后在4℃，15000rpm條件下離心10分鐘，然后吸取200μL上層清液于1.5mL離心管中，在室溫下真空濃縮干燥2小時得到肝臟代謝物；所述提取液為水、正己烷和氫氧化鈉溶液按體積比(2-4)：(3-5)：(1-3)進行均勻混合制成，且氫氧化鈉溶液的濃度為2mol/L；再通過甲醇水混合液二次萃取，4℃，400rpm條件下振搖10分鐘，所述甲醇水混合液中甲醇和水的體積比為1:1，而后在4℃，15000rpm條件下離心10分鐘；

S3、代謝物的衍生化處理：往真空濃縮干燥后的樣品中加入50μL濃度20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液，充分混勻后置于振搖儀上振搖2小時，后再加入100μL硅烷化試劑N-甲基-N三甲基硅烷三氟乙酰胺，充分混勻60秒后置于振搖儀上振搖30分鐘，反應后進行離心，并取適量上層清液轉移到帶有150μL內插管的進樣瓶內待用；

S4、GC-MS檢測：樣品采用氣相色譜質譜聯用儀進行檢測，其中色譜條件為：HP-5MS毛細管色譜柱，所述色譜柱規格為30m x 0.25mm,0.25μm，升溫程序為85℃恒溫5分鐘，而后以8℃/分鐘升溫到195℃，保持7分鐘，再以10℃/分鐘升溫到205℃，持續10分鐘，最后以10℃/分鐘升溫到300℃，持續10分鐘；質譜條件為：離子傳輸線溫度為280℃，離子源溫度為230℃，四級桿溫度為150℃，EM電壓為1070V，質量掃描范圍為m/z 50-1000；選擇“全掃描模式”和“選擇離子監測模式”分別進行掃描，先將全掃描方式采集的數據進行代謝物的定性分析，準確定性了豬肝臟中的64種物質，得到64種物質的保留時間、特征離子碎片，然后根據保留時間和特征離子碎片，采用選擇離子監測方式對64種物質進行準確定量分析。

2.根據權利要求1所述的一種基于GC-MS技術的高通量定量分析豬肝臟內源代謝物的方法，其特征在于：所述提取液為水、正己烷和氫氧化鈉溶液按體積比2:4:1進行均勻混合制成，且氫氧化鈉溶液的濃度為2mol/L。

3.根據權利要求1所述的一種基于GC-MS技術的高通量定量分析豬肝臟內源代謝物的方法，其特征在于：所述提取液為水、正己烷和氫氧化鈉溶液按體積比3：5：2進行均勻混合制成，且氫氧化鈉溶液的濃度為2mol/L。

4.根據權利要求1所述的一種基于GC-MS技術的高通量定量分析豬肝臟內源代謝物的方法，其特征在于：步驟S2中，樣品振搖條件為：4℃，400rpm條件下振搖10分鐘，過濾采用0.22μm的有機針相式濾膜過濾，甲醇水混合液中水和甲醇按體積比為1:1，離心條件為4℃，15000rpm條件下離心10分鐘。

5.根據權利要求1所述的一種基于GC-MS技術的高通量定量分析豬肝臟內源代謝物的方法，其特征在于：步驟S3中，樣品加入甲氧基胺鹽酸鹽后的振搖條件為37℃，200rpm條件下振搖肟化反應2小時，加入硅烷化試劑N-甲基-N三甲基硅烷三氟乙酰胺后的振搖條件為在37℃，200rpm條件下振搖硅烷化反應30分鐘，離心條件為4℃，15000rpm條件下離心10分鐘。

6.根據權利要求1所述的一種基于GC-MS技術的高通量定量分析豬肝臟內源代謝物的方法，其特征在于：步驟S4中，所述氣相色譜質譜聯用儀為7890A GC-5975C MSD氣相色譜質譜聯用儀，7693自動進樣器。

7.根據權利要求1所述的一種基于GC-MS技術的高通量定量分析豬肝臟內源代謝物的方法，其特征在于：步驟S4中，氣相色譜以純度99.999％的氦氣為載氣，進樣量為1μL，流速設置為1mL/分鐘，分流比50:1，進樣口溫度為270℃，溶劑延遲時間為4分鐘。