[發明專利]不同地區玉米粗縮病病原物的遺傳變異分析方法

在審

• 申請號: 201910936016.6
• 申請日: 2019-09-29
• 公開（公告）號: CN110747291A
• 公開（公告）日: 2020-02-04
• 發明（設計）人: 鐵雙貴;岳潤清;趙志杰;劉璐;陳娜;徐心志;盧董華
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6869;C12R1/94
• 代理公司: 41123 河南科技通律師事務所
• 代理人: 樊羿;張曉輝

本發明公開了一種不同地區玉米粗縮病病原物的遺傳變異分析方法，旨在解決現有技術中遺傳變異分析方法仍不夠準確、不夠完整客觀的技術問題。該遺傳變異分析方法包括：取不同地區葉片樣本提取葉片總RNA；以總RNA為模板進行反轉錄，得cDNA；以cDNA為模板進行RT?PCR；將各RT?PCR擴增產物純化回收后測序，分析比對出可信序列；將各可信序列與RBSDV的S9序列進行比對分析樣本的同源性、堿基突變、氨基酸的改變情況。本發明能夠明確致病原RBSDV在我國不同地區的遺傳變異情況，還可以進一步地揭示病毒的侵染傳毒機制，對研究和控制各地區病害的發生意義重大。

技術領域

本發明涉及分析生物學技術領域，具體涉及一種不同地區玉米粗縮病病原物的遺傳變異分析方法。

背景技術

玉米粗縮病是由水稻黑條矮縮病毒（RBSDV）引起的一種世界范圍的重要病害，RBSDV能夠侵染多種作物，包括水稻、玉米和小麥。各地爆發情況屢見報道，給當地玉米生產和全國的糧食安全帶來非常嚴重的破壞。玉米粗縮病的典型癥狀為植株矮小，節間明顯縮短，葉片顯得濃綠，葉背脈上有長短不等的白色蠟淚狀突起，整株葉片短脆硬直，根系不發達。

因此，明確致病原RBSDV在我國不同地區的遺傳變異情況，對研究和控制各地區病害的發生意義重大。

張恒木等應用RT-PCR技術克隆了2個RBSDV中國分離物即浙江分離物和河北分離物的基因組片段S7，并測定了它們的全序列，結果表明：2個中國分離物核苷酸同源性高達99%，與日本RBSDV基因組片段S7核苷酸同源性為93.4%和93.8%，與意大利MRDV S6核苷酸同源性為85.1%和85.3%；高瑞珍等對江蘇省2009年發生的水稻黑條矮縮病的病原進行了鑒定，結果表明江蘇省水稻黑條矮縮病與RBSDV中國分離物相應片段的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為93.3%～100%和97.4～100%，與SRBSDV相應片段的核苷酸和氨基酸同源性為77.4～79.5%。

然而，現有技術中，致病原RBSDV在不同地區的遺傳變異情況的分析仍不夠準確、不夠完整客觀。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種不同地區玉米粗縮病病原物的遺傳變異分析方法，以期解決現有技術中遺傳變異分析方法仍不夠準確、不夠完整客觀的技術問題。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

設計一種不同地區玉米粗縮病病原物的遺傳變異分析方法，包括以下步驟：

（1）取不同地區待測玉米粗縮病染病植物的葉片樣本，分別提取葉片總RNA；

（2）以所述總RNA為模板，分別利用核苷酸序列如SEQ ID NO.2的引物進行反轉錄，得cDNA；

（3）以所述cDNA為模板，分別利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2的引物進行RT-PCR；

（4）將各RT-PCR擴增產物純化回收后測序，分析比對出可信序列；

（5）將各可信序列與RBSDV的S9序列進行比對分析樣本的同源性、堿基突變、氨基酸的改變情況。

優選的，在所述步驟（3）中，RT-PCR的反應程序為：

94℃ 5min；94℃ 1min；60℃ 1min；72℃ 70s 35個循環；72℃10min；4℃保存。

優選的，在所述步驟（4）中，采用Clustal W 2.1分析比對可信序列。

優選的，在所述步驟（5）中，采用DNA man或Clustal W 2.1比對分析。

與現有技術相比，本發明的有益技術效果在于：