[發(fā)明專利]一種含一對(duì)二硫鍵的多肽藥物的固液相合成方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910933233.X
• 申請(qǐng)日: 2019-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN112574285B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁慧星;熊戰(zhàn)魁;尹傳龍;陶安進(jìn);余品香
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司;翰宇藥業(yè)（武漢）有限公司
• 主分類號(hào): C07K7/16
• 分類號(hào): C07K7/16;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/02
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 范盈

本發(fā)明公開了一種含一對(duì)二硫鍵的多肽藥物的固液相合成方法，包括以下步驟：1)采用Serb?Resin樹脂制備氨基酸樹脂F(xiàn)moc?AA?NHsubgt;2/subgt;?Serb?Resin，然后采用特定的弱酸敏感的保護(hù)基Fmoc氨基酸，合成肽樹脂；2)樹脂裂解，同時(shí)形成二硫鍵；3)沉淀得到粗肽。本發(fā)明的合成方法可以避免使用高濃度的TFA裂解，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)側(cè)鏈保護(hù)基脫保護(hù)、樹脂裂解、成環(huán)在同一條件下完成；采用0.5～1.5％碘?DCM溶液在裂解后期添加的策略，能夠在裂解的同時(shí)完成氧化，極大的簡化工藝，同時(shí)避免了二次制備；反應(yīng)畢濃縮1/2再進(jìn)行乙醚沉淀，即可得到純度較高的粗肽，且雜質(zhì)和主峰分離度較好，便于制備純化；該工藝操作簡單，操作步驟大大簡化，工期縮短，后處理方便。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物合成方法技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種含一對(duì)二硫鍵的多肽藥物的固液相合成方法。

背景技術(shù)

二硫鍵是由兩個(gè)巰基(SH)氧化而成的一類環(huán)狀化合物結(jié)構(gòu)，是多肽化合物中，常見的一種結(jié)構(gòu)形式。例如已上市多肽藥物：縮宮素、去氨加壓素、精氨酸加壓素、賴氨酸加壓素、特利加壓素、蘭瑞肽等等。

該類多肽產(chǎn)品的合成方法主要有兩大類，一類是液相合成；另一類是固相合成。其中液相合成的策略主要是采用片段縮合法，即合成不同片段，再片段縮合；比如十肽化合物精氨酸加壓素采用“4+6”、“5+5”、“3+7”等策略。最后再進(jìn)行氧化成環(huán)。而固相合成的策略主要是針對(duì)保護(hù)基策略和脫保護(hù)方法。比如精氨酸加壓素常用的策略有先合成全保護(hù)肽，再進(jìn)行切割得到線性肽，最后再通過氧化劑氧化等方式得到二硫的精氨酸加壓素。

具體到該類化合物的二硫鍵形成，主要也有兩大類：即液相氧化和固相氧化。多肽二硫鍵的固相氧化，通常步驟是：Fmoc固相合成策略合成多肽，然后采用一定量的碘進(jìn)行氧化成環(huán)，再進(jìn)行裂解，沉淀制備得到目標(biāo)肽。液相氧化大致過程是：固相合成多肽，然后裂解得到線性肽(不帶保護(hù)基的肽)，然后將線性肽溶解在水-乙腈等溶液體系，為防止分子間二聚等，通常采用較低濃度的體系，加入氧化劑(碘、氧氣、雙氧水等)進(jìn)行氧化成環(huán)，然后濃縮，制備得到目標(biāo)肽。

以上方法是多肽化合物形成二硫鍵的常用方法。

液相片段縮合存在合成周期長，合成操作繁瑣，后處理純化等比較復(fù)雜，粗肽純度低且需用到氫溴酸等強(qiáng)酸，不易放大生產(chǎn)，該方案已逐漸被多肽領(lǐng)域淘汰。

現(xiàn)今，F(xiàn)moc策略成為多肽合成中的主流策略。這類多肽按照氧化的形式又分為固相氧化和液相氧化。

液相氧化工藝大致如下：先固相合成肽樹脂，然后在強(qiáng)酸體系下裂解(10倍體積的95％TFA)，再制備得到線性肽，最后在極稀的濃度下進(jìn)行氧化(一般在1mg/ml，甚至0.5mg/ml)，最后在較大的反應(yīng)液體積的情況下二次制備，得到目標(biāo)化合物。該方法是現(xiàn)階段常規(guī)的精氨酸加壓素類多肽(精氨酸加壓素、縮宮素、特利加壓素等含有一對(duì)二硫鍵的多肽)的合成方案；該方案顯而易見的缺點(diǎn)是：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，需要兩次制備純化，且在線性肽氧化時(shí)，需要較大體積的溶劑溶解(防止二聚體產(chǎn)生，要求反應(yīng)濃度極稀)，因此在氧化后的純化工作時(shí)，大量溶劑的分離給純化工作帶來較大的工作量，且存在三廢處理麻煩，兩步純化的總收率較低等等問題。

固相氧化工藝大致如下：選用Trt或者M(jìn)mt保護(hù)巰基。采用Fmoc固相合成策略合成肽樹脂，然后采用10-15倍當(dāng)量的碘/DCM溶劑，一起在柱子中氧化1小時(shí)，反應(yīng)畢抽干樹脂，然后采用強(qiáng)酸(10倍體積的三氟乙酸)裂解肽樹脂，10倍體積的乙醚沉淀，制備，得到目標(biāo)化合物。該方法操作簡便，但是因?yàn)樵诠滔鄻渲羞M(jìn)行氧化，需要大量的碘(一般采用10-15倍當(dāng)量的碘)，反應(yīng)才能完全氧化成環(huán)，在精氨酸加壓素、縮宮素、去氨加壓素等多肽肽序中含有Tyr等易氧化基團(tuán)，因此采用該方案進(jìn)行固相氧化，雜質(zhì)多，粗肽純度低。

再者以上無論固相氧化還是液相氧化，均需要采用高濃度強(qiáng)酸(一般95％的三氟乙酸)進(jìn)行樹脂的裂解和保護(hù)基脫除。