[發明專利]一種5α-還原酶突變體，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生產中的應用

有效

• 申請號: 201910930886.2
• 申請日: 2019-09-29
• 公開（公告）號: CN110628735B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 王敏;申雁冰;任小賢;趙云秋;駱健美;夏夢雷
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/74;C12N1/21;C12P33/00;C12R1/32
• 代理公司: 天津諾德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 12213
• 代理人: 欒志超

1.一種5α-還原酶突變體，其特征在于：將序列如SEQ ID NO.2所示的5α-還原酶中第187位酪氨酸突變為苯丙氨酸，5α-還原酶突變體序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一種編碼權利要求1所述的5α-還原酶突變體的基因序列，其特征在于：序列如SEQID NO.3所示。

3.一種包含權利要求1所述的5α-還原酶突變體的基因工程菌的制備方法，其特征在于：將5α-還原酶基因和表達載體連接構建攜帶5α-還原酶基因的重組質粒，通過重疊延伸PCR進行定點突變獲得5α-還原酶突變體重組表達載體，轉入到主產AD的分枝桿菌中獲得5α-還原酶突變體的基因工程菌；

所述表達載體是大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體pMV261；

所述主產AD的分枝桿菌為MNR M3△ksdd。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：具體制備方法如下：

步驟一將5α-還原酶基因片段與表達載體pMV261連接構建得到重組質粒pMV261-5α；

步驟二以重組質粒pMV261-5α為模板，設計引物進行重疊延伸PCR，得到第187位氨基酸由酪氨酸突變為苯丙氨酸的5α-還原酶突變體重組表達載體pMV261-5α^Y187F；

步驟三將5α-還原酶突變體重組表達載體pMV261-5α^Y187F電轉到主產AD的分枝桿菌MNRM3△ksdd，獲得5α-還原酶突變體的分枝桿菌基因工程菌MNR M3△ksdd/pMV261-5α^Y187F；

步驟一中5α-還原酶基因片段序列如SEQ ID NO.1所示；

步驟二中引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

5.一種包含權利要求2所述的5α-還原酶突變體基因序列的重組表達載體。

6.根據權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于：表達載體是大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體pMV261。

7.一種包含權利要求1所述的5α-還原酶突變體的基因工程菌。

8.根據權利要求7所述的基因工程菌，其特征在于：宿主菌為主產AD的分枝桿菌為MNRM3△ksdd。

9.權利要求3或4所述的制備方法制備所得的5α-還原酶突變體的基因工程菌在5α-AD生產中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于：利用所述5α-還原酶突變體基因工程菌發酵制備5α-AD，按8%體積比的接種量轉接至發酵培養基中，28-32℃，130-250 r/min，pH6.5-7.8條件下，發酵4-8 d。

11.根據權利要求10所述的應用，其特征在于：所述發酵培養基組成為：K₂HPO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，檸檬酸鐵銨 0.05 g/L，檸檬酸 2 g/L，磷酸氫二銨 3.5 g/L，葡萄糖10 g/L，植物甾醇1-30 g/L，其余為水，pH為6.5-7.8。