[發明專利]一種5α-還原酶突變體，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生產中的應用

有效

• 申請號: 201910930886.2
• 申請日: 2019-09-29
• 公開（公告）號: CN110628735B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 王敏;申雁冰;任小賢;趙云秋;駱健美;夏夢雷
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/74;C12N1/21;C12P33/00;C12R1/32
• 代理公司: 天津諾德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 12213
• 代理人: 欒志超

本發明提供一種5α?還原酶突變體，通過定點突變改造的5α?還原酶獲得5α?還原酶突變體，構建其基因工程菌并應用在高效催化5α?AD生產中的應用，定點突變改造的5α?還原酶是將第187位酪氨酸突變為苯丙氨酸，將5α?還原酶突變體重組質粒電轉至分枝桿菌中進行異源表達，再對其酶活性和生產效率進行測定，發現5α?還原酶突變體的分枝桿菌基因工程菌酶活力提高了2.3倍，其催化效率提高了22.8％，對5α?AD的生產由原來的1.45g/L提高到了1.78g/L；將5α?還原酶突變體作為重要甾體藥物中間體生產的關鍵酶，可以明顯提高生物轉化的效率和產品的得率。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，尤其是涉及一種5α-還原酶突變體及其在高效催化5α-AD生產中的應用。

背景技術

甾體5α-還原酶屬于還原型輔酶II(NADPH)依賴型酶，其能夠催化一系列類固醇底物在4,5位雙鍵發生還原作用，并將C-5位上的氫加成在α位上成為相應的5α-還原產物。例如，睪酮(TS)在5α-還原酶的作用下被還原成一種活性更強的甾體激素：雙氫睪酮(DHT)，其在雄激素的生理調節以及人的兩性分化等方面，發揮著極其重要的作用；雄甾-4-烯-3,17二酮(AD)能夠在類固醇5α-還原酶的催化作用被還原為重要的甾體藥物中間體：5α-雄烯二酮(5α-AD)中間體。

一些化學法和生物法可用于合成重要甾體化合物5α-AD，但化學法往往伴隨著反應步驟多、環境污染大、過程不好控制等問題。生物法因其條件溫和、環境友好、專一性強等優勢，已越來越受關注。但現已發現的5α-還原酶，其對底物表現的活性并不能滿足工業化生產的要求，在一定程度上限制了其應用。隨著人們對5α-還原酶的功能和作用機理的認識的不斷深入，采用基因工程技術改造酶分子以獲得具有優良酶學性質的5α-還原酶，成為今后生物催化領域的另一發展趨勢。采用基因工程技術改造酶分子以獲得具有優良酶學性質的5α-還原酶，成為今后生物催化領域的另一發展趨勢。目前關于5α-還原酶的分子改造，主要是對底物睪酮的酶活力研究，而且其催化效率并不理想；5α-還原酶是催化AD生產5α-AD的關鍵酶，目前針對底物AD的5α-還原酶基因的改造還沒有報道。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種5α-還原酶突變體，基因工程菌及其在高效催化5α-AD生產中的應用。

本發明采用的技術方案是：一種5α-還原酶突變體，將5α-還原酶中的一個酪氨酸突變為苯丙氨酸。

優選地，將序列如SEQ ID NO.2所示的的5α-還原酶中第187位酪氨酸突變為苯丙氨酸，5α-還原酶突變體序列如SEQ ID NO.4所示。

一種編碼5α-還原酶突變體的基因序列，序列如SEQ ID NO.3所示。

一種包含5α-還原酶突變體的基因工程菌的制備方法，將5α-還原酶基因和表達載體連接構建攜帶5α-還原酶基因的重組質粒，通過重疊延伸PCR進行定點突變獲得5α-還原酶突變體重組表達載體，轉入到主產AD的分枝桿菌中獲得5α-還原酶突變體的基因工程菌；

優選地，表達載體是大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體pMV261。

優選地，主產AD的分枝桿菌為MNR M3△ksdd。

具體制備方法如下：

步驟一將5α-還原酶基因片段與表達載體pMV261連接構建得到重組質粒pMV261-5α；

步驟二以重組質粒pMV261-5α為模板，設計引物進行重疊延伸PCR，得到第187位氨基酸由酪氨酸突變為苯丙氨酸的5α-還原酶突變體重組表達載體pMV261-5α^Y187F；