[發明專利]一種高產L-賴氨酸的重組菌株及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201910926308.1
• 申請日: 2019-09-27
• 公開（公告）號: CN110607313B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 孟剛;馬風勇;周曉群;賈慧萍;蘇厚波;楊立鵬;高曉航;田斌
• 申請（專利權）人: 內蒙古伊品生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N15/74;C12N1/21;C12P13/08;C12R1/15;C12R1/19
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 田芳

本發明提供一種高產L?賴氨酸的重組菌株及其構建方法與應用，包括一種改造的pobB基因編碼多核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列，并且提供該多核苷酸序列編碼的重組蛋白、含有所述多核苷酸序列的重組菌株，所述重組菌株的構建方法及其在發酵產L?賴氨酸中的應用。本發明的重組菌株通過對于野生型谷氨酸棒狀桿菌中pobB基因開放閱讀框編碼區的核苷酸序列進行點突變，獲得pobB基因編碼區改造的重組菌株，相比于野生菌株實現了L?賴氨酸產量的提高。

技術領域

本發明屬于基因工程和微生物技術領域，具體涉及一種高產L-賴氨酸的重組菌株及其構建方法與應用。

背景技術

L-賴氨酸是人體和動物生命活動所必需的八大氨基酸之一。L-賴氨酸具有多種生理功能，例如調節代謝平衡，促進人體發育，促進機體對谷類蛋白質和其他氨基酸的吸收，增強免疫功能等，被廣泛應用于食品添加劑、動物飼料、藥物合成等各個方面。

L-賴氨酸的生產方法主要包括蛋白水解法和微生物發酵法等。其中微生物發酵法因為生產工藝容易控制，生產能力高等優勢已經稱為工業上生產L-賴氨酸最常用的方法。微生物發酵法是通過發酵可代謝合成賴氨酸的微生物，利用其微生物代謝作用，實現L-賴氨酸在發酵液中的累積。

用于生產L-賴氨酸的微生物包括多個種屬，例如棒狀桿菌、芽孢桿菌、埃希氏菌等。但是，野生型菌株產L-賴氨酸的能力差，代謝副產物多，難以實現高純度和高產量L-賴氨酸的制備。因此，通常需要獲得高產L-賴氨酸的菌株。目前，獲得高產菌株的方法主要包括誘變篩選育種或者基因工程育種。誘變育種是指通過紫外照射或者其他外界條件刺激，誘導菌株發生不特定的基因位點突變，然后通過篩選獲得高產菌株，這種方法缺乏方向性，基因突變位點難以控制，對菌株性能的預期性差?；蚬こ淌峭ㄟ^明確的基因改造方式來優化選育菌株，例如通過增加拷貝或者定點突變導入酶活性提高的有益的酶基因，或者通過敲除不理基因使酶活性/表達消失。谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)作為使用最普遍的產L-賴氨酸菌種，二氨基庚二酸(DAP)途徑是其主要的L-賴氨酸生物合成途徑。DAP途徑存在四種不同的變化形式用于合成meso-DAP，包括：脫氫酶途徑，琥珀酰化酶途徑，乙酰化酶途徑和轉氨酶途徑。谷氨酸棒桿菌同時存在脫氫酶途徑和琥珀?；竿緩?。脫氫酶途徑只需經過一個酶促反應就可生成meso-DAP(即二氨基庚二酸脫氫酶DDH)，進而生成L-賴氨酸。為了提高谷氨酸棒狀桿菌生物合成途徑中L-賴氨酸的積累，提高其代謝途徑中NADPH量或降低L-賴氨酸合成途徑中NADPH需求量是非常重要的策略。但是，胞內過量的NADPH會阻礙菌體細胞對糖類的利用，影響菌體生長和L-賴氨酸的積累。因此，構建具有L-賴氨酸的高產菌株仍具有重大意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種高產L-賴氨酸的重組菌株及其構建方法與應用。具體而言，本發明提供一種改造的pobB基因編碼多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼的重組蛋白，含有所述多核苷酸序列的重組菌株，所述重組菌株的構建方法及其在發酵產L-賴氨酸中的應用。本發明的重組菌株通過對于野生型谷氨酸棒狀桿菌中pobB基因開放閱讀框編碼區的核苷酸序列進行點突變，獲得pobB基因編碼區改造的重組菌株，相比于野生菌株實現了L-賴氨酸產量的提高。

本發明采用如下技術方案實現：

本發明的第一方面，提供一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的野生型pobB基因編碼序列第139和811位堿基發生突變形成的多核苷酸序列。

根據本發明，所述突變是指所述位點的堿基/核苷酸發生變化，所述突變方法可以選自誘變、PCR定點突變法、和/或同源重組等方法中的至少一種。

根據本發明，所述突變為SEQ ID NO:1中第139位和第811位堿基均由鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A)；具體地，所述突變后的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。

本發明的第二方面，提供如上所述的多核苷酸序列編碼的重組蛋白。