[發明專利]一種改善豬體外原代黃體細胞功能的方法

在審

• 申請號: 201910921476.1
• 申請日: 2019-09-27
• 公開（公告）號: CN110669720A
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發明（設計）人: 劉國世;王靜;張魯;姬鵬云;李廣棟;呂東穎;吳昊
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 11392 北京衛平智業專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 張新利;謝建玲

本發明提供了一種改善豬體外原代黃體細胞功能的方法，所述方法通過在體外原代黃體細胞培養液中添加褪黑素，從而提高黃體分泌孕酮水平。本發明所述方法中添加濃度10^?9M～10^?5M的褪黑素可以提高黃體分泌孕酮水平，有利于改善黃體功能，為褪黑素在大家畜上的應用推廣，為達到提高母豬繁殖力的目的研究中提供理論參考。

技術領域

本發明屬于農業類畜牧獸醫領域，具體地涉及一種通過在細胞培養液中添加褪黑素提高黃體分泌孕酮水平的方法。

背景技術

母豬繁殖效率低是制約我國養豬業健康快速發展的關鍵因素之一，母豬繁殖性能直接影響豬場的經濟效益。黃體(CL)是一種可以產生孕酮的內分泌腺，對調節發情和維持妊娠至關重要。黃體功能不足影響胚胎附植及妊娠維持，黃體分泌孕酮水平異常是導致母畜不孕或習慣性流產的主要原因。

褪黑素是一種由松果體分泌的激素，目前研究表明褪黑素參與調節生物節律、睡眠和免疫細胞分化等，同時是一種重要的生殖激素。褪黑素在卵母細胞線粒體中合成，可以促進卵母細胞成熟，同時緩解熱應激對豬卵母細胞及內質網損傷。褪黑素還能促進顆粒細胞黃體化，提高附植效率，維持妊娠。但褪黑素參與母豬卵巢黃體功能的調控機理尚不清楚。

現有技術已公開了部分物種黃體中褪黑素相關合成酶和受體表達情況，褪黑素可以促進人黃體細胞孕酮合成，但抑制狒狒和馬黃體細胞中孕酮的產生。褪黑素是否對豬原代黃體細胞孕酮分泌有影響未見報道。

鑒于現有研究和技術中存在的問題，本發明將褪黑素應用到豬體外原代黃體細胞培養中，通過在培養液中添加的方式，最終提高黃體細胞分泌孕酮水平。

發明內容

針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種通過在培養液中添加褪黑素來改善豬體外原代黃體細胞，促進孕酮合成分泌的方法。

本方法的研究對象實例為豬體外原代黃體細胞，但本方法不僅適用豬，還適用于排卵后和妊娠過程中有黃體參與的其他家畜(牛、羊等)。

為達到以上目的，本發明采取的技術方案是：

一種改善豬體外原代黃體細胞功能的方法，向細胞培養液中添加褪黑素，褪黑素的濃度為10^-9M～10^-5M；

具體包括以下步驟：

一、豬原代黃體細胞的分離

1.將含有黃體的卵巢從屠宰場獲得后置于冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中并在2小時內運輸到實驗室；

2.用PBS洗滌卵巢3-5次，然后將卵巢轉移到細胞培養皿中，選擇淺粉紅色或黃色且黃體部分來自黃體周期早期和中期的黃體，用剪刀剪下鑲嵌在卵巢上的黃體，并迅速置于PBS中；

3.在超凈工作臺中，將取下的每個黃體沿著黃體中間剪開，去掉黃體被膜層，將黃體部分與黃體被膜層分開，黃體部分置于100mL小燒杯；

4.在小燒杯中加入50mL PBS，輕輕吹打后，棄去液體；

5.重復一次步驟4；

6.將黃體部分轉移至玻璃皿中，剪刀剪碎，機械分離黃體部分；

7.將分離得到的黃體組織轉移入15mL離心管，加入與黃體組織大致相同體積的0.1％膠原酶II，放在37.5℃、130rpm的水浴搖床中，震蕩消化20min；

8.消化結束后，用移液槍反復吹打50次左右，放在水浴鍋中再震蕩消化20min，消化后用移液槍反復吹打50次左右，1500r/min離心5min，在超凈工作臺中棄掉液體；

9.再加入8-10mL的PBS，反復吹打重懸細胞，1500r/min離心5min，在超凈工作臺中棄掉液體；