[發(fā)明專利]一種改善豬體外原代黃體細(xì)胞功能的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910921476.1
• 申請(qǐng)日: 2019-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN110669720A
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉國世;王靜;張魯;姬鵬云;李廣棟;呂東穎;吳昊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 11392 北京衛(wèi)平智業(yè)專利代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 張新利;謝建玲

1.一種改善豬體外原代黃體細(xì)胞功能的方法，其特征在于，向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加褪黑素，褪黑素的濃度為10^-9M～10^-5M。

2.如權(quán)利要求1所述的改善豬體外原代黃體細(xì)胞功能的方法，其特征在于，所述改善豬體外原代黃體細(xì)胞功能的方法，具體包括以下步驟：

一、豬原代黃體細(xì)胞的分離

(1)將含有黃體的卵巢從屠宰場(chǎng)獲得后置于冰冷的PBS中并在2小時(shí)內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室；

(2)用PBS洗滌卵巢3-5次，然后將卵巢轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，選擇淺粉紅色或黃色且黃體部分來自黃體周期早期和中期的黃體，用剪刀剪下鑲嵌在卵巢上的黃體，并迅速置于PBS中；

(3)在超凈工作臺(tái)中，將取下的每個(gè)黃體沿著黃體中間剪開，去掉黃體被膜層，將黃體部分與黃體被膜層分開，黃體部分置于100mL小燒杯；

(4)在小燒杯中加入50mL PBS，輕輕吹打后，棄去液體；

(5)重復(fù)一次步驟(4)；

(6)將黃體部分轉(zhuǎn)移至玻璃皿中，剪刀剪碎，機(jī)械分離黃體部分；

(7)將分離得到的黃體組織轉(zhuǎn)移入15mL離心管，加入與黃體組織相同體積的0.1％膠原酶II，放在37.5℃、130rpm的水浴搖床中，震蕩消化20min；

(8)消化結(jié)束后，用移液槍反復(fù)吹打50次，放在水浴鍋中再震蕩消化20min，消化后用移液槍反復(fù)吹打50次，1500r/min離心5min，在超凈工作臺(tái)中棄掉液體；

(9)再加入8-10mL的PBS，反復(fù)吹打重懸細(xì)胞，1500r/min離心5min，在超凈工作臺(tái)中棄掉液體；

(10)再加入8-10mL的紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打重懸細(xì)胞，冰上靜置8-10min，1500r/min離心5min，在超凈工作臺(tái)中棄掉液體；

(11)如果在下層沉淀中還看到有紅色，重復(fù)步驟(10)；

(12)收集的細(xì)胞沉淀后加入合適體積的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打重懸細(xì)胞，用70mm濾器過濾細(xì)胞重懸液，將收集的濾液1500r/min離心5min，在超凈工作臺(tái)中棄掉液體；

二、將黃體細(xì)胞沉淀以3.5×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸于有10％血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加褪黑素，褪黑素的濃度為10^-9M～10^-5M，然后接種到6孔板中，每孔培養(yǎng)液2mL，在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

三、細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液和黃體細(xì)胞，黃體細(xì)胞中加PBS重懸，5000r/min離心5min收集黃體細(xì)胞，加800微升trizol于-20℃，保存?zhèn)溆茫?xì)胞培養(yǎng)液測(cè)定孕酮含量，黃體細(xì)胞用于熒光定量檢測(cè)孕酮合成相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)。