[發明專利]胞內勞森菌的培養方法及應用

在審

• 申請號: 201910918323.1
• 申請日: 2019-09-26
• 公開（公告）號: CN110468088A
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發明（設計）人: 謝書宇;陳冬梅;袁宗輝;羅萬和;武夢茹;孟奎宇;潘源虎;瞿瑋;程古月;黃玲利;謝長清;王旭;陶燕飛;劉振利
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N5/071;C12R1/01
• 代理公司: 11335 北京匯信合知識產權代理有限公司
• 代理人: 張煥響<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明公開了一種胞內勞森菌的培養方法，包括以下步驟：步驟1：貼壁培養豬腸道細胞；步驟2：待細胞貼壁培養6～8h，將胞內勞森菌與細胞培養液按體積比0.01～1:1接種至細胞中，置于改良的微需氧環境中培養1～96h；步驟3：胰酶消化感染的細胞后，收集感染細胞，并用細胞凍存液重懸感染細胞，轉入液氮罐中保存。還公開由所述的培養方法培養的胞內勞森菌的應用，應用于胞內勞森菌分離培養和病原性特征的研究中。本發明應用豬腸道細胞來培養胞內勞森菌，嚴格模擬宿主體內的體外培養環境，并且應用改良后的微需氧培養箱來培養胞內勞森菌，操作簡單，培養周期短，成本低，大大增加培養胞內勞森菌的成功率。

技術領域

本發明屬于獸用生物技術領域，具體涉及一種胞內勞森菌的培養方法及應用。

背景技術

胞內勞森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)屬于脫硫弧菌屬，革蘭氏陰性菌，呈弧形彎曲狀、逗點狀或S形，大小為1.25～1.75μm×0.25～0.43μm，專性寄生于動物腸道細胞中，可引起以回腸和結腸隱窩內未成熟的腸細胞腺瘤樣增生為特征的豬增生性腸炎(PPE)。雖PPE死亡率不高，但該病可引起病豬腹瀉、生長緩慢等臨床癥狀，嚴重降低動物的飼料利用率，進而造成巨大的經濟損失。據報道，美國和英國每年因PPE造成的損失分別高達2000萬美元、400萬英鎊。在歐洲，估計每年該病對每頭育肥豬造成的損失超過1歐元。此外，該病呈世界規模流行，感染率非常高。據報道，加拿大、芬蘭、巴西、法國、南非、希臘、泰國、印度、日本、朝鮮、中國等20多個國家均有LI感染，特別是在歐美國家發病率較高。在自然界中LI能通過多種途徑傳播，如鳥類、鼠、昆蟲等動物性傳播，人員、設備、車輛等流動性傳播。為了更好地防治PPE，LI的培養和鑒定顯得尤為重要。

LI屬于嚴格的胞內菌，不能在常規的培養基中生長，只能生長在細胞中，如IEC-18,McCoys,Hep-2，henle407和IGPC-1651等細胞；此外，該菌微需氧且必須在一個特殊的氣體環境中才可以生長。因其特殊的培養條件，目前全世界成功分離到的菌株不足25株，現保存的菌株更少，國內至今沒有成功分離培養的相關報道。現如今，對于LI的培養，使用最多的是智能多氣培養箱和微需氧產氣袋。但是智能多氣培養箱價格昂貴，很多實驗室難以達到相應硬件要求；而微需氧產氣袋雖然價格便宜，但是操作不便，使實驗難以控制，對細胞和細菌的培養有一定的影響。

另外，利用宿主細胞培養細菌可以更好地反應細菌在宿主體內的侵襲和繁殖特性，增加分離和培養LI的成功率。但目前報道中培養LI所用的細胞，不是來源于宿主細胞，不能完全反應胞內勞森菌在豬胃腸道的感染特性；此外，現有技術細胞培養周期長，對于該菌后期的分離檢測很不利。

鑒于現有技術存在的問題，本發明通過改進微需氧培養培養條件，采用宿主細胞來培養LI，通過普通PCR、熒光定量PCR和過氧化物酶單層染色(IPMA)的方法來鑒定其培養結果，并優化細菌感染時間和劑量，以及制作生長曲線，這些對于分離LI以及后期研究PPE具有重要的意義。

發明內容

本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優點。

本發明還有一個目的是提供一種胞內勞森菌的培養方法，改變了傳統的LI培養方法，操作簡單，培養周期短，利于后期對于該菌進行分離和鑒定。

本發明還有一個目的是提供一種由所述的培養方法培養的胞內勞森菌的應用，應用于胞內勞森菌分離培養和病原性特征的研究中。

為了實現本發明的這些目的和其它優點，提供了一種胞內勞森菌的培養方法，包括以下步驟：

步驟1：貼壁培養豬腸道細胞；

步驟2：待所述豬腸道細胞貼壁培養6～8h，將胞內勞森菌與細胞培養液按體積比0.01～1:1接種至細胞中，置于改良的微需氧環境中培養1～96h；