[發明專利]胞內勞森菌的培養方法及應用在審
| 申請號： | 201910918323.1 | 申請日： | 2019-09-26 |
| 公開（公告）號： | CN110468088A | 公開（公告）日： | 2019-11-19 |
| 發明（設計）人： | 謝書宇;陳冬梅;袁宗輝;羅萬和;武夢茹;孟奎宇;潘源虎;瞿瑋;程古月;黃玲利;謝長清;王旭;陶燕飛;劉振利 | 申請（專利權）人： | 華中農業大學 |
| 主分類號： | C12N1/20 | 分類號： | C12N1/20;C12N5/071;C12R1/01 |
| 代理公司： | 11335 北京匯信合知識產權代理有限公司 | 代理人： | 張煥響<國際申請>=<國際公布>=<進入 |
| 地址： | 430070 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 細胞 豬腸道 應用 改良 宿主 收集感染細胞 體外培養環境 細胞貼壁培養 細胞凍存液 細胞培養液 分離培養 感染細胞 培養周期 貼壁培養 需氧環境 胰酶消化 病原性 培養箱 體積比 需氧 液氮 重懸 成功率 接種 并用 體內 轉入 保存 感染 研究 | ||
1.一種胞內勞森菌的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟1：貼壁培養豬腸道細胞；
步驟2：待所述豬腸道細胞貼壁培養6～8h，將胞內勞森菌與細胞培養液按體積比0.01～1:1接種至細胞中，置于改良的微需氧環境中培養1～96h；
步驟3：胰酶消化感染步驟2中培養的細胞后，收集感染細胞，并用細胞凍存液重懸感染細胞，轉入液氮罐中保存。
2.如權利要求1所述的胞內勞森菌的培養方法，其特征在于，所述豬腸道細胞為豬空腸上皮細胞IPEC-J2、豬小腸上皮細胞ZYM-DIEC02或豬小腸上皮細胞IPEC-1。
3.如權利要求1所述的胞內勞森菌的培養方法，其特征在于，步驟1中貼壁培養細胞，具體包括以下步驟：
S1：從液氮罐取出細胞，迅速在37℃水浴鍋中搖晃，并在1min之內完全融化；
S2：將融化的細胞加入DMEM完全培養基中，于37℃、5％CO2培養箱中培養；所述細胞在完全培養基中的濃度為0.5×106/mL～2×108/mL；
S3：待細胞貼壁生長后，用PBS緩慢清洗細胞2～3次，待細胞匯合度達到80％～90％時，用胰酶消化細胞，將細胞懸液混勻并平鋪于24孔板中，每孔中細胞懸液和DMEM完全培養基按體積比1:9加入，混勻后于培養箱中培養。
4.如權利要求3所述的胞內勞森菌的培養方法，其特征在于，S3中細胞懸液的濃度為0.5×106/mL～2×108/mL。
5.如權利要求1所述的胞內勞森菌的培養方法，其特征在于，步驟2中所述胞內勞森菌濃度為104.9TCID50/ml。
6.如權利要求1所述的胞內勞森菌的培養方法，其特征在于，步驟2中所述改良的微需氧培養環境是由以下步驟構建：
將N2、CO2和O2按體積比為80～95:5～10:0～10注入儲氣罐后，再連接至微需氧培養箱，使培養箱中的氣體環境為試驗所需的微需氧環境。
7.如權利要求6所述的胞內勞森菌的培養方法，其特征在于，所述N2、CO2和O2體積比為80～87:8～10:5～10。
8.如權利要求1所述的胞內勞森菌的培養方法，其特征在于，步驟2中所述胞內勞森菌與細胞培養液按體積比0.1～0.3:1接種至細胞中。
9.如權利要求1所述的胞內勞森菌的培養方法，其特征在于，步驟2中在微需氧環境中培養1～12h。
10.由權利要求1-9任一項所述的培養方法培養的胞內勞森菌的應用，其特征在于，應用于胞內勞森菌分離培養和病原性特征的研究中。
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