[發明專利]一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法

在審

• 申請號: 201910914704.2
• 申請日: 2019-09-26
• 公開（公告）號: CN112553151A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 丁小梅
• 申請（專利權）人: 深圳光彩生命工程技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京中仟知識產權代理事務所(普通合伙) 11825
• 代理人: 田江飛

本發明公開了一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法，按照以下步驟進行制備：S1：制取上清液：人臍帶間質樣本收集于第一離心管中，在9℃、250g離心10分鐘，分離得到上層液體；將所述上層液體移入第二離心管中，在8℃、11000g離心10分鐘，分離得到上清液；本發明通過制取上清液，分離得到上層液體，將上層液體移入第二離心管中，三次連續離心，底部得到固相物質，移除上層清液后為人臍帶間質干細胞總外泌體，外泌體在蔗糖中重懸，分離得到上清液離心、免疫磁珠法取得重懸液，羥基磷灰石純化柱進行分離純化外泌體，多次對外泌體進行純化，使得提純效果好，減少了雜質。

技術領域

本發明涉及外泌體純化技術領域，具體為一種人臍帶間質干細胞外泌體 的分離純化方法。

背景技術

外泌體(Exosome)是一種穿梭在細胞間具有雙分子層的納米級囊泡。外泌 體可由多種細胞分泌到細胞外，不同細胞分泌的外泌體可以具有類似的或不 同的特性和生物學功能。

現有的從人臍帶間質中提取外泌體的方法復雜且設備要求高，現有技術的 獲取的外泌體重懸液含大量雜蛋白，并非為純凈的外泌體，僅為含外泌體的 混合液，因為此，我們推出一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法， 以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種人臍帶間質干細胞外 泌體的分離純化方法，按照以下步驟進行制備：

S1：制取上清液：人臍帶間質樣本收集于第一離心管中，在1～9℃、250～ 600g離心10～15分鐘，分離得到上層液體；將所述上層液體移入第二離心 管中，在3～8℃、9000～11000g離心10～15分鐘，分離得到上清液；

S2：連續離心：將步驟S1中取得的上清液，總外泌體抽提液以1:1的體 積比在第三離心管混合，震蕩均勻后，在無血清且去除外泌體的培養液中于 37℃培養箱孵育48h后，上清液經400g，第一次離心1～10分鐘、3000g第 二次離心10～20分鐘，10000g第三次離心10～20分鐘，在所述第三離心管 的底部得到固相物質，移除上層清液后為人臍帶間質干細胞總外泌體；

S3：將步驟S1中取得的人臍帶間質干細胞總外泌體用60000g的SW28轉 子濃縮90～120分鐘，外泌體沉淀在0.32M蔗糖中重懸，然后100000g離心 1-3個小時，留做備用；

S4：用免疫磁珠法，取得重懸液留作備用；

S5：將步驟S4中取得的重懸液，加入第四離心管中，將所述第四離心管 置于磁力架，吸附2～10分鐘，移除管內液體，在第四離心管中得到磁珠結 合的外泌體；

S6：向第四離心管中加入pH值為7～8的磷酸緩沖液，然后將第四離心 管置于磁力架吸附3～8分鐘，再移除管內液體，從而對磁珠結合的外泌體進 行清洗；

S7：利用柱平衡液處理羥基磷灰石純化柱，使純化柱上各基團處于活化 狀態，將步驟S6處理后的外泌體樣本加入至上述活化的羥基磷灰石純化柱進 行分離純化外泌體；

S8：利用洗滌液洗滌羥基磷灰石純化柱，再用洗脫液分別洗脫樣品中的 外泌體，取得經洗滌后純化柱；

S9：所述經洗滌后純化柱用含50～200mM NaPO，0.1～10mM EDTA，pH為 6.5-7.5的洗脫液孵育1～5min，4℃，2000～5000rpm離心1-5min，所得洗 脫組分為高純度外泌體，并進行保存。

優選的，所述柱平衡液為50～500mM NaPO，0.1～10mM EDTA，pH為6.0～ 7.0。

優選的，所述洗滌液為1～15mM NaPO，0.1～15mM EDTA；100mM～1M NaCl， pH為6.0～7.0。