[發明專利]一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法

在審

• 申請號: 201910914704.2
• 申請日: 2019-09-26
• 公開（公告）號: CN112553151A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 丁小梅
• 申請（專利權）人: 深圳光彩生命工程技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京中仟知識產權代理事務所(普通合伙) 11825
• 代理人: 田江飛

1.一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法，其特征在于：按照以下步驟進行制備：

S1：制取上清液：人臍帶間質樣本收集于第一離心管中，在1～9℃、250～600g離心10～15分鐘，分離得到上層液體；將所述上層液體移入第二離心管中，在3～8℃、9000～11000g離心10～15分鐘，分離得到上清液；

S2：連續離心：將步驟S1中取得的上清液，總外泌體抽提液以1:1的體積比在第三離心管混合，震蕩均勻后，在無血清且去除外泌體的培養液中于37℃培養箱孵育48h后，上清液經400g，第一次離心1～10分鐘、3000g第二次離心10～20分鐘，10000g第三次離心10～20分鐘，在所述第三離心管的底部得到固相物質，移除上層清液后為人臍帶間質干細胞總外泌體；

S3：將步驟S1中取得的人臍帶間質干細胞總外泌體用60000g的SW28轉子濃縮90～120分鐘，外泌體沉淀在0.32M蔗糖中重懸，然后100000g離心1-3個小時，留做備用；

S4：用免疫磁珠法，取得重懸液留作備用；

S5：將步驟S4中取得的重懸液，加入第四離心管中，將所述第四離心管置于磁力架，吸附2～10分鐘，移除管內液體，在第四離心管中得到磁珠結合的外泌體；

S6：向第四離心管中加入pH值為7～8的磷酸緩沖液，然后將第四離心管置于磁力架吸附3～8分鐘，再移除管內液體，從而對磁珠結合的外泌體進行清洗；

S7：利用柱平衡液處理羥基磷灰石純化柱，使純化柱上各基團處于活化狀態，將步驟S6處理后的外泌體樣本加入至上述活化的羥基磷灰石純化柱進行分離純化外泌體；

S8：利用洗滌液洗滌羥基磷灰石純化柱，再用洗脫液分別洗脫樣品中的外泌體，取得經洗滌后純化柱；

S9：所述經洗滌后純化柱用含50～200mM NaPO，0.1～10mM EDTA，pH為6.5-7.5的洗脫液孵育1～5min，4℃，2000～5000rpm離心1-5min，所得洗脫組分為高純度外泌體，并進行保存。

2.根據權利要求1所述的一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法，其特征在于：所述柱平衡液為50～500mM NaPO，0.1～10mM EDTA，pH為6.0～7.0。

3.根據權利要求1所述的一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法，其特征在于：所述洗滌液為1～15mM NaPO，0.1～15mM EDTA；100mM～1M NaCl，pH為6.0～7.0。

4.根據權利要求1所述的一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法，其特征在于：所述免疫磁珠法指準備25μL預涂有免疫球蛋白G的免疫磁珠與30μL抗CD9單克隆抗體孵育1～2個小時，其后，免疫磁珠與20μg外泌體在4℃混懸1～2個小時，清洗4次后，外泌體和磁珠在PBS中再次重懸。

5.根據權利要求1所述的一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法，其特征在于：所述洗脫液為200-500mMNaPO，0.1-10mM EDTA，pH為6.5-7.5。

6.根據權利要求1所述的一種人臍帶間質干細胞外泌體的分離純化方法，其特征在于：將步驟S9中取得的高純度外泌體20μL與納米多肽凝膠溶液混合均勻，中靜置5min，使其凝固，在-4℃進行保存。