[發明專利]應用TLC-CMS技術評價紅棗中植物甾醇抗氧化性的方法

有效

• 申請號: 201910914632.1
• 申請日: 2019-09-26
• 公開（公告）號: CN110632237B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 楊衛民;王繼秀;段劉榮;秦永其;杜京旗;張利軍
• 申請（專利權）人: 呂梁學院
• 主分類號: G01N30/90
• 分類號: G01N30/90;G01N30/94;G01N30/95
• 代理公司: 太原科衛專利事務所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源;武建云

1.一種應用TLC-CMS技術評價紅棗中植物甾醇抗氧化性的方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）、微波超聲技術粗提甾醇

材料的預處理：以紅棗仁或者紅棗核為原料，清洗后55℃烘干，粉碎過80目篩，備用；

樣品的制備：以乙酸乙酯為提取劑，稱取紅棗仁粉或紅棗核粉于容器中，料液比1:15；微波超聲波萃取時間為40min、萃取功率為400W；萃取后4000r/min離心10min，過濾3次，濃縮，用氯仿定容；

標準溶劑的制備：取標準β-谷甾醇，色譜甲醇定溶，配成1mg/ml的標準溶劑待用；

（2）、TLC分離純化甾醇

點樣：用微量進樣器吸取50μL β-谷甾醇標準品溶液，置于全自動點樣機上，設置點樣參數：點樣間距10mm、點樣寬度8mm、點樣數目3、點樣量分別為5μL、10μL、15μL、點樣速度5s/μL，在硅膠板上進行點樣，再吸取10μL供試品溶液，點樣10μL；

展開：配制石油醚:乙酸乙酯=10:1的體積比混合溶液，再滴加一滴乙酸，靜置作為展開劑，倒入展開缸中，讓其在展開缸中氤氳 20~30分鐘直至飽和，將點樣完成的硅膠G板輕輕放入展開劑液面高10~15mm的平臥式展開缸內，待到展開劑前沿距離硅膠板頂端1cm處時，取出，晾干；

顯色：待硅膠板干燥后均勻噴灑10%硫酸乙醇溶液，放于105℃烘箱中烘至斑點顯色清晰；

拍照：將顯色過后的層析板放入薄層色譜成像系統，在365nm的紫外光燈下拍照，觀察層析情況，拍照記錄；

雙波長薄層掃描法進一步測定β-谷甾醇含量：薄層色譜掃描儀將待測薄層板進行雙波長掃描，通過軌跡跟蹤確定斑點位置參數后，掃描確定斑點最大和最小吸收峰值，用反射掃描測定目標斑點峰面積，利用峰面積與點樣量的線性關系確定目標斑點物質含量；

（3）、CMS檢測甾醇

質譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度290℃；母離子285m/z；激活電壓1.5V；質量掃描范圍35~500；檢測方式SRM模式；

對標準β-谷甾醇的檢測：取20μg/ml β-谷甾醇標準品，用微量進樣器吸取10μL，排氣泡后將進樣處從Load檔移至Inject檔，微量進樣，圖譜分析；

對樣品的檢測：將分離純化好的薄層板放在TLC-質譜接口上，用激光校準位置，開始運行進行取樣，圖譜分析；

（4）、紅外檢測

將液體工作臺安置好，打開軟件，預熱30min后，使用擦鏡紙將金剛石擦拭干凈，測定背景光，繼而使用毛細管在金剛石處滴一滴β-谷甾醇標準液，得其官能團圖譜；繼而將薄層板上分離純化好的斑點進行摳樣，用色譜甲醇溶解，離心，用毛細管取上清液至金剛石臺面進行檢測，并與標準品比對分析；

（5）、抗氧化測定

同等濃度下的V_C、V_E與甾醇對DPPH·的清除能力的測定

對DPPH自由基清除能力的測定：取若干試管，準確吸取濃度為100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、20μg/mL的β-谷甾醇樣品液0.1mL，分別加入0.06mmoL/L的DPPH溶液3.50mL，嚴格避光30min，在515nm處測得吸光值，記為A_i；再取5支試管吸取不同濃度的樣品提取液0.1mL，各加入甲醇溶液3.50mL，測量吸光值，記為A_j；再取1支試管準確吸取DPPH溶液3.50mL，加入0.10mL甲醇溶液后測量其吸光值，記為A₀；配備和樣品提取液相同濃度梯度的VC和VE甲醇溶液，作為實驗對照組；各吸光度值均取測量三次后的平均值：清除率S=[1–(A_i–A_j)/A₀]×100%；

同等濃度下的V_C、V_E與甾醇對OH自由基的清除率

對OH·清除能力的測定：配置1.0mL 9mmol/L的FeSO₄、1.0mmol/L的H₂O₂溶液于37℃恒溫條件下反應15min，在536nm處測其吸光值A₀，然后分別加入20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的甾醇樣品以及V_C、V_E的甲醇溶液，在536nm處測其吸光值A_x；每個樣品重復3次，取平均值；OH·清除率的計算公式是：清除率S=(A₀–A_x)/A₀×100%。