[發明專利]一種基于CRISPR技術定向遺傳改造米曲霉基因的方法

在審

• 申請號: 201910911608.2
• 申請日: 2019-09-25
• 公開（公告）號: CN110592073A
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發明（設計）人: 張哲;曾斌;龍傳南;范俊俠
• 申請（專利權）人: 江西科技師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N9/22;C12N15/63
• 代理公司: 36135 南昌大牛專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 喻莎

本發明提供了利用一種可以在Aspergillus屬真菌內進行自主復制的穿梭載體，并通過組成型啟動子PgpdA啟動表達cas9，定向遺傳改造米曲霉基因的方法，該方法消除了載體插入位點和培養基組分對cas9表達的影響，提高了基因編輯效率，并且能夠產生無標記(Marker?Free)的米曲霉工程菌，免除對轉基因的擔憂，提高轉基因改造米曲霉的實用性。

技術領域

本發明涉及生物技術的基因工程領域，具體涉及利用CRISPR技術定向遺傳改造米曲霉基因的方法。

背景技術

米曲霉用于醬油、米酒等食品發酵已有悠久的歷史，因此被認為是國際公認的食品安全級的真菌。2005年米曲霉基因組測序工作的完成，為加快遺傳改造米曲霉，使其成為高效生產酶制劑、真菌代謝產物的理想菌株奠定了基礎。但由于米曲霉多核，表型多變，對常用篩選標記藥物不敏感，導致遺傳改造米曲霉進展緩慢，工業生產應用受限。

當前米曲霉遺傳操作的成功與否依賴于兩個因素：第一個是篩選標記的選擇；第二個是同源同組的效率問題。由于米曲霉對多種抗性藥物不敏感，使得米曲霉遺傳轉化篩選主要依賴于營養缺陷型菌株的構建，而營養缺陷型菌株的構建費時，工作量大，其效率取決于同源重組的效率。目前研究表明，敲除參與非同源重組途徑的基因能夠促進同源重組效率，這些基因主要有ku70，ku80，LigD。因此，為了提高米曲霉遺傳操作，常常需要構建ku70，ku80，LigD和營養雙缺陷菌株。而且，對于工業應用中常需要轉化多個基因，這樣就需要構建包含多個營養缺陷的菌株，這無疑加大了遺傳改造米曲霉的難度。此外，多個營養缺陷篩選標記的構建勢必造成宿主菌株表型和代謝的改變，這對于后續利用該遺傳改造的菌株造成影響。

利用CRISPR-Cas系統在真菌中進行基因編輯，能夠很好的解決上述問題。首先CRISPR-Cas系統敲除基因的效率不依賴于同源同組，這樣免去了敲除ku70，ku80，LigD的繁瑣；其二，CRISPR-Cas系統可利用一個營養缺陷篩選標記完成對多個基因的遺傳改造。這些恰好解決了上述傳統的同源重組改造米曲霉的困難。但CRISPR-Cas系統也有一些弊端。例如CRISPR-Cas表達盒若插入到異染色質上，引起Cas9表達量低，造成基因編輯效率低；在米曲霉中常利用α淀粉酶誘導型啟動子amyB啟動表達Cas9，該啟動子受培養基中碳源類型誘導表達，而碳源類型對米曲霉的生長影響大，從而影響后續轉基因表型鑒定；無法形成無標記(Marker-Free)的工程菌株，引起人們對轉基因的擔憂。為了解決上述CRISPR-Cas系統的問題，本發明通過利用一種可以在Aspergillus屬真菌內進行自主復制的穿梭載體，并通過組成型啟動子PgpdA啟動表達cas9，使cas9的表達不受插入位點及培養基組分影響，提高基因編輯效率，并能夠形成Marker-Free工程菌株。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何高效的遺傳改造米曲霉基因。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種基于CRISPR技術定向突變米曲霉基因的方法。

本發明所提供的基于CRISPR技術定向突變米曲霉基因的方法中，所包括的步驟如下：

1)以cas9序列(Katayama等人(2016)Biotechnol Lett 38:637–642)為參考，人工合成cas9基因，其核苷酸序列為序列1所示的DNA分子；以上述人工合成的cas9基因為模板，以序列SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的DNA片段為引物，執行PCR擴增獲得的cas9 DNA分子重組連接到載體pEX1上(該載體出自于Nguyen等人(2016)World J Microbiol Biotechnol，32:204)。所述重組載體為將pEX1的XhoI和BamHI識別序列間的DNA替換為序列1所示的DNA分子得到的重組載體pEX1-cas9。pEX1-cas9重組載體含有由構巢曲霉基因gpdA基因啟動子PgpdA，序列1所示的cas9基因，trpC基因終止子(TtrpC)三部分組成的序列2所示的cas9蛋白表達盒，即PgpdA-cas9-TtrpC。